発生早期の鳥類頚髄における運動神経細胞死の過程で働く因子の検討

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15790108
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 小池 正人 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (80347210)
• キーワード: オートファジー / MAP-LC3 / GFP / 鳥胚 / 頚髄 / プログラム細胞死 / カスパーゼ / 阻害剤

研究概要

LC3のN末にGFPをつないだコンストラクトが実際使用可能か検討するため、まずラットPC12細胞の発現させ、イムノブロットにてGFP-LC3蛋白が産生されているか検討を行った。その結果GFPとLC3の間で原因不明のプロセシングが起こることが判明した。そこでGFPの代わりに酸性オルガネラ内にても輝度の低下を起こさない改変GFPであるSapphire遺伝子を用いたところ、Sapphire-LC3蛋白の生成が確認されたためこのコンストラクトを用いることにした。
次に、孵卵2日目(Hamburger-Hamiltonのステージ13〜14)の胚の脊椎中心管内に遺伝子を注入する手技を確立した。エレクトロポレータの条件設定を行なった結果、25Vのパルスを150msの間隔で50ms間6回加えるのが胚の致死を惹起することなく効率よく遺伝子を導入出来る条件であることが分かった。
遺伝子導入1日後の胚をin ovoで蛍光実体顕微鏡下で観察したところ、Sapphire蛋白の蛍光が胚内に確認された。蛍光は、脊髄に沿って認められることもあれば、主に後根神経節に認められるものもあった。蛍光実体顕微鏡で遺伝子導入が確認された胚を化学固定の後凍結切片を作製し、抗LC-3抗体にて免疫染色を行なった結果、Sapphire蛋白の分布と一致することが確認された。
頸髄前角のプログラム細胞死の時期に於けるSapphire-LC3の挙動を確認するため、遺伝子導入が確認された胚を、孵卵4〜5日目(遺伝子導入後2〜3日)で採取、同様に凍結切片で観察したところ、後根神経節では比較的Sapphire蛋白の蛍光が認められたが、Islet-1陽性の脊髄前角の運動神経細胞に於けるSapphire蛋白の発現はほとんど認められなかった。現在効率よく運動神経細胞に遺伝子導入出来る条件を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Ishii, T ら: "A case of multicentric Castleman's disease demonstrating severe eosinophilia and enhanced production of interleukin-5."Eur.J.Haematol. 70巻・2号. 115-118 (2003)
• [文献書誌] Ohsawa, Y ら: "Purification, cDNA cloning, and secretory properties of FLRG protein from PC12 cells and the distribution of FLRG mRNA and protein in rat tissues."Arch.Histol.Cytol.. 66巻・4号. 367-381 (2003)
• [文献書誌] Ezaki, J ら: "Characterization of Cln3p, the gene product responsible for juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis, as a lysosomal integral membrane glycoprotein."J.Neurochem.. 87巻・5号. 1296-1308 (2003)
• [文献書誌] Kobayashi, K ら: "Survival of developing motor neurons mediated by Rho GTPase signalina pathway through Rho-kinase."J.Neurosci.. (印刷中).
• [文献書誌] Mori, Y ら: "The discovery of a second form of tripartite complex containing gH-gLof human herpesvirus-6, and the CD46 observations."J.Virol.. (印刷中).