|
これまでにWntシグナルを抑制的に制御するセリン/スレオニンキナーゼであるNLKが、コリプレッサー蛋白質であるTLE/Grouchoファミリーと複合体を形成する事が質量分析法を用いた解析から示唆されていた。そこで本実験においてはまず、TLE/Grouchoファミリー分子のクローニングを行い、ヒトTLE1、TLE2、TLE3、AES1をそれぞ単離した。培養細胞にTLE/GrouchoファミリーとNLKを共発現させ、これらが複合体を形成するか免疫沈降法で検討した所、TLE1がNLKと共沈する事が確認された。さらにTLE1、TLE2、TLE3それぞれをNLKと同時に細胞内で発現させると、TLE1、TLE2、TLE3の泳動度が遅くなる事がわかった。この泳動度の変化はフォスファターゼ処理により消失したので、リン酸化によるものである事がわかった。TLEのN末側の領域のみからなるAES1の泳動度はNLKと同時に発現しても変化しなかったため、TLEのC末側の領域がリン酸化を受けると考えられた。現在TLEのNLKによってリン酸化される残基を特定する実験を進めている。また、NLKを同時に発現する事でTLE1のリプレッサー活性がやや上昇する傾向が見られた。この結果はNLKによる直接のリン酸化によってTLE/Grouchoファミリーの活性制御されている可能性を示唆しており、今後リン酸化部を変異させたTLE/Grouchoファミリー分子を用いて更に解析を進めて行きたいと考えている。
|
