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病原性大腸菌は腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管侵襲性大腸菌、腸管凝集粘着性大腸菌の5つのカテゴリーに分類される。本研究では病原性大腸菌について病原遺伝子検出による迅速なカテゴリー推定及び産生する病原因子の検出法の開発を目指している。
前者の病原遺伝子検出によるカテゴリー推定として、本研究では、各カテゴリーの併せて9種類以上の遺伝子を同時にPCRにより検出するmultiplex PCRの開発を行っている。5つのカテゴリー型別を可能とする9種類以上の病原因子遺伝子同時増幅による病原性大腸菌同定は、分離菌の病原性判定だけではなく臨床での迅速な下痢起因病原性大腸菌の診断に応用できる。本年度では病原性大腸菌すべてのカテゴリーを決定するmultiplex PCR法に関しては10種類及び12種類の病原因子を同時に検出できるmultiplex PCRの構築を、大腸菌純培養試料を用いて行った。このカテゴリーを決定するmultiplex PCR法については現在、その結果を論文にまとめつつある。また、EHEC multiplex PCR系に関しても新規ベロ毒素検出プライマーを開発し、検出系の構築を試みた。この成果に関しては日本細菌学会にて発表(平成16年4月)した。
また、後者の病原因子発現の検出に関しては、mRNAをモニタリングすることで、感染に重要な役割を担う付着・分泌系病原因子等の産生条件を明らかにすることを試みた。そこで、本年度では病原因子発現検出系に関してはRT-PCRによるmRNA定量を検討した。その結果、EHEC・EPECの病原遺伝子発現時におけるmRNA定量条件が明らかになった。また、解析の過程として上記病原遺伝子の発現パターンの異なる臨床由来EHEC株が幾つか判明した。これらのmRNA定量に関してはリアルタイムPCRを用いて定量パターンの厳密な比較を行う予定である。病原因子タンパクの発現条件の解析は病原因子検出法確立に活用できると同時に簡易な病原性菌の分離法の開発、病原因子の遺伝子発現制御機構の解明への道を開くことが期待される。
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