| 研究概要 |
<研究結果と進行状況>
多発性骨髄腫細胞株としてU266,RPMI8226を用いた。プロテアソーム阻害剤として、MG132、Lactacystin、PS-341 (Bortezomib, Vercade^<TM>)を用いた。各細胞株を、対数増殖期およびプロテアソーム阻害剤(0.01,0.1,1.0,10x10^<-6>M)存在下で培養した。培養時間は、24hr,48hr,72hrと様々な条件に設定し、それぞれから細胞内蛋白質(水溶性画分,尿素溶性画分)を調整した。これらの試料をもとに、SDS-PAGEおよび抗ユビキチン抗体を用いたWestern blottingにより解析した。MG-132を1.0nM存在下で48hr培養した時の細胞抽出液(水溶性画分)に、多量のユビキチン化蛋白質の蓄積が認められた(IC_<50>は2.0nM)。同条件で、1.0x10^<10>のU266細胞を大量に培養し、その抽出液を試料とした。これを元に、抗ユビキチン抗体FK2を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行った。非吸着成分をリン酸バッファーでwash outし、吸着成分を3.5.M MgCl_2入りのTrisバッファーにて溶出した。その後リン酸バッファーで透析し、遠心濃縮を行った。溶出液は、ELISAにてマルチユビキシン鎖が高値を示していること、また、Western blottingにより、ユビキチン結合蛋白質が回収できていることを確認した。現時点ではここまでしか終了していない。今後は、ゲル濾過を用いて、標的蛋白質を含む高分子成分のみを分離する。その後、Endoproteinase ASP-Nによる基質蛋白質の消化、ユビキチンC末端ペプチド抗体(UC1抗体)を用いたアフィニティークロマトグラフィー・逆相HPLCによるペプチド断片の分離、およびプロテインシークエンサーによる標的蛋白質群の精製・同定を行う予定である。
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