| 研究概要 |
本年度はES細胞導入用の候補遺伝子のサブクローニングとコンストラクトの作製及びES細胞への遺伝子導入とstable cell lineの構築を主な目的として行った。
・転写因子遺伝子のクローニングと遺伝子導入用ベクターへのサブクローニング
マウス胎仔のcDNAライブラリーをテンプレートとして、PCRによりPtx1,Pit1をそれぞれ増幅しクローニングした後シークエンスを確認した。具体的には両端にattB siteを付加するようにそれぞれ候補遺伝子に特異的なプライマーをデザインし、PCR法にて増幅した。これをInvitrogen社のGatewayテクノロジーによりCMVプロモーターを有するほ乳類発現ベクターpTRex-DEST-31(G418耐性)にサブクローニングした。
・テトラサイクリン添加誘導による発現調節可能なES細胞のクローニング
あらかじめテトラサイクリン発現調節用のベクター(zeocin耐性)を導入したES細胞に上記のコンストラクトをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor:LIF)を添加した高グルコースD-MEM培地、G418存在下でpositive selectionを行った。その結果、未分化なPit1およびPtx1導入ES細胞をstable cell lineとして各数クローンずつ樹立できた。さらにそれぞれのcloneをテトラサイクリン存在下で目的のタンパク発現を誘導した後、Western blottingにより発現量をチェックし、発現量の高いcell lineを以降の実験に使用した。
・ES細胞の分化誘導の検討
上記のようにクローニングしたcell lineを用いて様々な条件下で分化誘導をかけた細胞をRT-PCRにより発現している各段階のマーカーをmRNAレベルで検出する。また同時に分化した細胞をマーカーの抗体を用いて免疫染色する。来年度以降はこれらを指標として目的遺伝子の発現時期及び発現量の調整、さらには増殖因子などの培養条件を検討し、最適な条件を検討していく予定である。
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