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1.CDT処理細胞のプロテオーム解析
Actinobacillus actinomycetemcomitans(A.a菌)が産生する細胞膨化致死毒素(Cytolethal Distending Toxin;CDT)の作用機序を解明するためにCDT処理後の細胞を用いて二次元電気泳動によるプロテオーム解析を試みた。HeLa細胞を用いてCDT処理前後のタンパク質発現パターンを比較した結果、処理条件を変化させても特に明瞭な変化を示すタンパク質のスポットは得られなかった。今後は細胞抽出液の分画、濃縮等を行うことでより微量なタンパク質を検出できるようにすることが必要と考えられる。
2.CDT結合タンパク質の検索
A.a菌のCDTが作用する際に標的細胞内のタンパク質と相互作用をしている可能性が考えられるため、CDT結合タンパク質の検索を行った。まず始めにCDTの活性中心とされるCdtBサブユニットの組換えタンパク質を大腸菌で発現させて精製した。次に、得られた組換えCdtBタンパク質を抗原としてウサギを免疫し、抗CdtB抗体を作製した。この抗体をセファロース樹脂に結合させてアフィニティー精製用の担体を作製し、CDT処理細胞を用いてCdtB結合タンパク質の検出を試みた。その結果、作製したアフィニティー精製用担体を用いることでCDT処理細胞抽出液中のCdtBを銀染色で検出可能な程度まで濃縮することが可能となった。しかし、現在の実験条件ではセファロース樹脂と非特異的に結合するタンパク質が多数存在することなどから、CdtBと特異的に結合するタンパク質の検出には至っていない。今後は精製の条件等をさらに検討する必要があると考えられる。
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