研究課題
目的は、花バチのスクラーゼ(SUCase)と多糖合成酵素(PSase)が示す新しい現象の分子解析と応用である。SUCaseの優れた特徴は基質阻害と生成物阻害が極めて低く「高基質濃度で活発に反応できる点」にある。この低阻害に関わる構造因子を決定し、高基質濃度で高活性な酵素を作製する。PSaseは多糖を糖転移と糖鎖伸長で合成するが、我々は「両反応が別個の部位で生じる」と推測した。その理由は、C末端領域を除去すると糖鎖伸長のみが低下したからである。現在、支持されている機構は「両反応が活性部位の1箇所で触媒」である。C末領域の糖鎖伸長に関わる構造因子を決定し、一般説を精査する。また、新規サイズの糖質を生産できる有用PSaseを作製する。SUCaseの阻害解除現象に関与する残基としてGlnとLeuを昨年度明らかにした。さらにTyrを含めた多重変異体を評価した。GlnとLeu、TyrとGln、LeuとTyrの各置換による2重変異酵素、Gln・Leu・Tyrを置換した3重変異酵素を作製した。高濃度ショ糖への活性を測定すると、Gln→Asn/Leu→Hisに親酵素より大きい阻害解除が観察され、基質阻害や生成物阻害を低減させた置換酵素の取得に成功した。一方、立体構造は得られなかったが、相同酵素の構造からGlnとLeuは活性部位の近傍に存在が推定された。相同酵素の塩依存性活性化も解析した。PSaseのC末端除去実験から候補アミノ酸を推定した。変異導入により伸長反応が低下したので、本残基を糖鎖伸長の第2の構造因子と推察した。しかし、完全に伸長現象が消失していないので、さらなる構造因子の存在が考えられる。生成物のサイズ分析から長鎖型オリゴ糖の生成を確認した。酵素結晶が得られなかった。その理由として分子量が10万を超える巨大タンパク質であることが考えられた。転移の新たな反応機構を提案した。
28年度が最終年度であるため、記入しない。
すべて 2016 その他
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (1件) (うち国際学会 1件) 備考 (1件)
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
巻: 80 ページ: 479-485
DOI:10.1080/09168451.2015.1116926
http://www.agr.hokudai.ac.jp/rfoa/abs/abs2-3.html