| 研究課題/領域番号 |
15F15345
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| 研究機関 | 甲南大学 |
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研究代表者 |
杉本 直己 甲南大学, 先端生命工学研究所, 教授 (60206430)
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| 研究分担者 |
RODE AMBADAS 甲南大学, 先端生命工学研究所, 外国人特別研究員
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| 研究期間 (年度) |
2015-11-09 – 2018-03-31
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| キーワード | リボスイッチ / アプタマー / ＦＭＮ / 相互作用 / 分子クラウディング / エンタルピー / エントロピー |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、遺伝子の発現制御に関わる機能性核酸であるリボスイッチに着目し、溶液環境や核酸の高次構造を考慮しつつ制御分子である代謝産物との相互作用を定量的に解析することで、細胞内における遺伝子発現制御システムを合理的に構築するための一般法則を得ることを目的としている。
当該研究年度では、フラビンモノヌクレオチド（FMN）を制御分子とするリボスイッチのアプタマードメインを解析した。天然の生物に由来するFMNを認識するリボスイッチのアプタマードメインを合成し、細胞内環境を考慮した分子クラウディング環境下においてFMNとの相互作用を定量的に解析した。その結果、希薄な溶液環境ではFMNとアプタマードメインが相互作用するためにマグネシウムイオンが必須であるのに対し、分子クラウディング環境下では、マグネシウムイオンの非存在下でもFMNとアプタマードメインとの相互作用が維持されることが明らかとなった。また、2mMのマグネシウムが存在する希薄溶液条件下と、マグネシウム非存在下で15wt%の平均分子量200のポリエチレングリコールで誘起した分子クラウディング環境下では、同程度の結合親和性を示すことが分かった。一方で、等温滴定型熱量測定（ITC）を用いた詳細な熱力学的解析を行うことにより、マグネシウムイオン存在下と分子クラウディング環境下では、まったく異なる機構でFMNとアプタマードメインが相互作用していることが示唆された。特に、分子クラウディング環境下では結合に伴う大きなエンタルピー変化とエントロピー変化が認められたことから、アプタマードメインの構造変化を伴う相互作用が起こっているのではないかと考えられる。この研究成果は、構造変化を利用して遺伝子の発現を調節するというリボスイッチの機能発現機構に対して、分子クラウディングという細胞内環境が大きく関与していることを示すものである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当該研究課題では、天然のリボスイッチに由来するアプタマードメインと代謝産物との相互作用を、熱力学的、および速度論的に定量的な解析を行い、細胞内における遺伝子発現制御システムを合理的に構築するための一般法則を得ることを目的としている。そのためには、細胞内という特殊な化学環境（分子クラウディング環境）を考慮した実験系で解析を進めることが重要である。当該研究年度においては、分子クラウディング環境が、FMNとFMNを認識するアプタマーとの相互作用を促進することを明らかにした。また、その相互作用メカニズムを明らかにするために、ITCによる熱力学的な定量解析を行った。分子クラウディング環境については、これまでにもリボザイム活性の促進効果を示すことなどが明らかになっている。当該研究年度で得られた研究成果は、アプタマーと標的代謝産物との相互作用に対する分子クラウディング環境の重要性を示すだけではなく、高次構造の形成により機能を発揮する核酸分子に対する分子クラウディング効果の一般則を説明づける知見を与えるものであり、当初の研究計画以上の成果が得られていると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
分子クラウディング環境におけるアプタマードメインのダイナミックな構造変化を伴うFMNとの相互作用が示唆されたことから、分子クラウディング環境におけるアプタマードメインの標的分子選択性（特異性）が希薄溶液条件とどの程度異なるのかを解析する。また、同様の検討を天然に存在するFMN以外の代謝産物を認識するアプタマードメインを用いて行い、分子クラウディングという環境がその他のアプタマードメインに対しても等しく効果を発揮するか否かを検討する。一方で、分子クラウディング環境下における核酸構造のダイナミックな変化を伴う相互作用が、反応の速度に対してどのように影響するのかを速度論的に解析する。分子内で形成されるアプタマードメインの高次構造領域を変異させて解析を行うことで、律速となる高次構造の形成領域を明らかにする。
細胞内環境を模倣した実験系での定量的な解析で得られる知見は、合理的な遺伝子発現制御システムの設計に活かすことができると考えられる。
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