| 研究課題/領域番号 |
15F15386
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
深井 周也 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 准教授 (10361792)
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| 研究分担者 |
TAKAHASHI TOMIO 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 外国人特別研究員
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| 研究期間 (年度) |
2015-11-09 – 2018-03-31
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| キーワード | 分子認識 / DNA修復 / タンパク質複合体 / ユビキチン / X線結晶構造解析 / 構造生物学 |
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| 研究実績の概要 |
BRCC36を触媒サブユニットとする脱ユビキチン化酵素（DUB）複合体は，K63結合型ユビキチン鎖（K63鎖）を特異的に切断する活性を持ち，DNA損傷応答や炎症・感染応答においてK63鎖を介した分子シグナル経路を制御する．本研究では，BRCC36複合体の一つであるBRISC複合体とK63鎖との複合体の立体構造をX線結晶構造解析や電子顕微鏡解析により決定し，複数の制御サブユニットによって担われるK63鎖特異的な切断機構を解明する．BRCC36のみならず，DUBの多くは複合体を形成して機能するが，複合体内では触媒活性や基質特異性が制御されるメカニズムは全く分かっていない．本研究で明らかとなるBRCC36 DUB複合体の活性制御メカニズムは，複合体として機能するDUBの活性制御メカニズムの理解にも役立つことが期待される．初年度は，BRISC複合体の結晶化条件と発現コンストラクトの検討により再現性を高めることができたが，高分解能のデータセットを収集するには至らなかった．また，理化学研究所との共同研究で行ったクライオ電子顕微鏡解析でも立体像を得るには至らなかった．今年度は，結晶の凍結条件の再検討などによる分解能の向上を目指したが，構造決定に適する分解能の回折データを得るには至らなかった．また，これまで結晶化を行ってきたマウス由来の複合体に加えて，ヒトおよびゼブラフィッシュ由来の複合体の発現系を構築し，結晶化に適する量と質の複合体を調製した．結晶化スクリーニングを行ったが，結晶は得られなかった．K63結合型ジユビキチンとBRISC複合体との複合体のクライオ電子顕微鏡解析においても立体像を得るには至らなかった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度に行ったマウス由来BRISC複合体の結晶化条件や発現コンストラクトの検討により，結晶化の再現性や大きさを改善するノウハウが得られた．それに基づいて，ヒトおよびゼブラフィッシュ由来のBRISC複合体の発現系を短期間に構築することができ，精製と結晶化スクリーニングまで順調に進んだが，残念ながら結晶は得られなかった．また，マウス由来のBRISC複合体の結晶についても，結晶凍結条件の再検討による分解能の向上を図ったが効果は見られなかった．K63結合型ジユビキチンとBRISC複合体との複合体のクライオ電子顕微鏡解析でも立体像を得るには至らなかった．実験自体はスムーズに進めることができたが，得られた結果は期待どおりとはいかなかったので，全体的にはやや遅れていると判断した．
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒトおよびゼブラフィッシュ由来のBRISC複合体の結晶化については，スクリーニングを開始したばかりであるので，結晶化条件や発現コンストラクトには改善の余地がある．引き続き結晶化条件や発現コンストラクトの検討を行う．分解能の高低に関わらず，結晶が得られた時点で試料の均一性が高いと判断してクライオ電子顕微鏡による構造解析も試みる．また，非常に低い分解能ではあるが，BRCC36複合体のもう一つの複合体であるBRCA1複合体の解析が報告されたので，その結果を参考にしてBRCA1複合体の解析も検討する．
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