神経および血管細胞可塑性研究を基盤とした膜貫通型受容体立体構造解析システムの創成

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15GS0312
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 祖父江 憲治 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (20112047)
• 研究分担者: 柴田 克志 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (70296565) ; 林 謙一郎 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (90238105) ; 乾 誠 山口大学, 医学部, 教授 (70223237) ; 今野 大治郎 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (00362715)
• キーワード: 構造生物学 / X線構造解析 / G蛋白質共役型受容体 / ミリスチン酸化 / 膜ターゲッティング / 膜蛋白質クラスター / 可塑性 / PSD-Zip45

研究概要

構造生物学の隆興により、X線構造解析や核磁気共鳴法を用いてシグナル伝達分子・細胞骨格蛋白質・転写因子・足場蛋白質(scaffold protein)など水溶性蛋白質の立体構造が解明されてきた。この結果、リガンド結合部(活性部位)や蛋白質間結合ドメイン構造の詳細が明らかになり、この構造情報を基に新規標的蛋白質の検索・拮抗ペプチトや創薬の開発なと研究の広がりを見せている。細胞膜蛋白質であるG蛋白質共役型受容体(GPCR)は、外来刺激(光・匂い味・フェロモン)・脂質・オータコイト・神経伝達物質・ヌクレオチドなど多種類のリガンドを受容体とし、現在1000種類近くの巨大ファミリーを形成すると推測されている。このように、GPCRを初めとした膜貫通型受容体の構造解析による研究の発展性と応用が期待されているが、研究の進展は遅れている。最大の理由は膜貫通型受容体が非水溶性蛋白質であり、可溶化→結晶化→立体構造解析という従来の構造生物学的手段が通用しない点にある。本研究は、生細胞の細胞膜上でGCRを含む膜貫通型受容体を、改変PSD-Zip45を用いて細胞質側から2次元準結晶レベルのクラスター化を行い、このクラスターの高純度精製標品を極低温電子顕微鏡を用いて立体構造解析することにより、普遍的な膜貫通型蛋白質立体構造解析システムの確立を目的としている。
本年度は、以下の研究を実施した。
1)本研究の中心となるPSD-Zip45の細胞膜ターゲッティングシステムに関して、各種膜ターゲッティングシグナルをPSD-Zip45に挿入し比較・検討を行い、ミリスチン酸化シグナルが膜ターゲティングに最も効果的であることを見い出した。
2)そこで、膜ターゲティングPSD-Zip45大量安定発現系として、ミリスチン酸化PSD-Zip45恒久的発現細胞のクローン化中である。
3)PSD-Zip45に相応する自己クラスター化能を有する末梢神経シナプス由来足場蛋白質ラプシンとPSD-Zip45による膜蛋白質クラスター化能を比較、PSD-Zip45がより強力なクラスター化能を示すことを明らかにした。
4)不飽和LPA受容体、エンドセリン受容体、神経伝達物質受容体(NMDA,AMPA,代謝グルタミン酸、ドーパミンにPSD-Zip45結合配列を付加し、PSD-Zip45による各種受容体クラスター化を比較、本実験に用いる受容体を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Usui S.et al.: "Synaptic targeting of PSD-Zip45 (Homer 1c) and its involvement in the synaptic accumulation of F-actin."J.Biol.Chem.. 278. 10619-10628 (2003)
• [文献書誌] Ebihara T.et al.: "Synchronized formation and remodeling of postsynaptic densities : long-term visualization of hippocampal neurons expressing pontsynaptic density proteins tagged with green fluorencent protein."J Neurosci.. 23. 2170-2181 (2003)
• [文献書誌] Takahashi M.et al.: "Epiregulin an a major antocrine/paracrine factor released from the ERK- and p38MAPK-activated vascular smooth muscle cells."Circulation. 108. 2524-2529 (2003)
• [文献書誌] Yoshida K.et al.: "Vascular remodeling induced by naturally occurring unsaturated lysophosphatidic acid in vivo."Circulation. 108. 1746-1752 (2003)
• [文献書誌] Hori K.et al.: "MALS is a binding partner of IRSp53 at cell-cell contacts."FEBS Lett.. 554. 30-34 (2003)
• [文献書誌] Ohkawa Y, et al.: "Calcineurin-mediased pathway involved in the differentiated phenotype of smooth muscle cells."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 301. 78-83 (2003)
• [文献書誌] Yamada N.et al.: "Role of the C domain of IGFs in the synergistic promotion with a substance P-derived peptide of rabbit corneal epithelial wound healing."Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.. in press. (2004)
• [文献書誌] Iwamoto T.et al.: "Differential modulation of NRI-NR2A and NRI-NR2B subtypes of NMDA receptor by PDZ domain-containing proteins."J.Neurochem. in press. (2004)