神経および血管細胞可塑性研究を基盤とした膜貫通型受容体立体構造解析システムの創成

2004 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15GS0312
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 祖父江 憲治 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (20112047)
• 研究分担者: 乾 誠 山口大学, 医学部, 教授 (70223237) ; 林 謙一郎 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (90238105) ; 柴田 克志 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (70296565)
• キーワード: 構造生物学 / X線構造解 / G蛋白質共役型受容体 / ミリスチン酸化 / 膜ターゲティング / 膜蛋白質クラスター / 可塑性 / PSD-Zip45

研究概要

構造生物学の隆興により、X線構造解析や核磁気共鳴法を用いてシグナル伝達分子・細胞骨格蛋白質・転写因子・足場蛋白質など水溶性蛋白質の立体構造が解明されてきた。しかしながら、GPCRを初めとした膜貫通型受容体の構造解析による研究の発展性と応用が期待されているにもかかわらず、研究の進展は遅れている。最大の理由は膜貫通型受容体が非水溶性蛋白質であり、可溶化→結晶化→立体構造解析という従来の構造生物学的手段が通用しない点にある。本研究は、生細胞の細胞膜上でGPCRを含む膜貫通型受容体を、改変PSD-Zip45を用いて細胞質側から2次元準結晶レベルのクラスター化を行い、このクラスターの高純度精製標品を極低温電子顕微鏡を用いて立体構造解析することにより、普遍的な膜貫通型蛋白質立体構造解析システムの確立を目的としている。本年度は、以下の研究を実施した。
1.膜ターゲティングシグナルであるミリスチン酸化およびパルミチン酸化したPSD-Zip45を限定条件で発現誘導する細胞をクローン化した。
2.PSD-Zip45を上回る自己集積能を有する新規PSD足場蛋白質の検索とシナプス可塑性の研究目的として、一連のPSD特異的モノクロナール抗体を用いて、PSD-Zip140,PSD180,PSD40などの候補蛋白質を見い出した。神経シナプス可塑性への役割と、膜クラスター化への応用の可能性を検討中である。
3.LPA受容体、エンドセリン受容体、神経伝達物質レセプターにPSD-Zip45結合配列を付加し、上記1)でクローン化した細胞を用いてクラスター化の検討を行ない、PSD-Zip45によるドーパミンD1レセプターの細胞膜面上でのクラスター化に成功した。現在このクラスターの可溶化と精製を進行中で、極低温電子顕微鏡による立体構造解析に向けた準備を行っている。

研究成果

• [雑誌論文] NMDA receptor-dependent synaptic translocation of insulin receptor substrate p53 via protein kinase C signaling (2005)
  • 著者名/発表者名: Hori K.et al.
  • 雑誌名: J.Neurosci. (in press)
• [雑誌論文] Dynamic subpopulation of postsynaptic density molecules is critically dependent on actin cytoskeleton (2005)
  • 著者名/発表者名: Kuriu T. et al.
  • 雑誌名: Neuron (in press)
• [雑誌論文] Determination of absolute numbers of postsynaptic molecules in single hippocampal excitatory synapses (2005)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama Y. et al.
  • 雑誌名: Neuron (in press)
• [雑誌論文] Requirement of the transmembrane semaphorin Sema4C for myogenic differentiation (2005)
  • 著者名/発表者名: Ko J-A., et al.
  • 雑誌名: FEBS Lett. (in press)
• [雑誌論文] Homozygous mutation (L527R) of TGFβ1 in an individual with lattice corneal dystrophy (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamada N. et al.
  • 雑誌名: Br.J.Ophthalmol. (in press)
• [雑誌論文] Collaboration of PSD-Zip70 with its binding partner, SPAR, in dendrtic Spine maturity (2005)
  • 著者名/発表者名: Maruoka H. et al.
  • 雑誌名: J.Neurosci. 25・6 ページ: 1421-1430
• [雑誌論文] Involvement of the phosphatidylinositol 3-kinase/rac1 and cdc42 pathways in radial migration of cortical neurons (2005)
  • 著者名/発表者名: Konno D. et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280・6 ページ: 5082-5088
• [雑誌論文] Sensitizing effect of substance P on corneal epithelial migration induced by IGF-1, fibronectin, or interleukin-6 (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamada N. et al.
  • 雑誌名: Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 46・3 ページ: 833-839
• [雑誌論文] Insulin receptor substrate-1/SHP-2 interaction, a phenotype-dependent switching machinery of insulin-like growth factor-I signaling in vascular smooth muscle cells (2004)
  • 著者名/発表者名: Hayashi K. et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279・39 ページ: 40807-40818
• [雑誌論文] Differential modulation of NR1-NR2B subtypes of NMDA receptor by PDZ domain-containing proteins (2004)
  • 著者名/発表者名: Iwamoto T et al.
  • 雑誌名: J.Neurochem. 89・1 ページ: 100-108
• [雑誌論文] Role of the C domain of IGFs in the synergistic promotion with a substance P-derived peptide of rabbit corneal epithelial wound healing (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamada N. et al.
  • 雑誌名: Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 45・4 ページ: 1125-1131
• [雑誌論文] Signal transduction regulating the vascular smooth muscle phenotype and early molecular events of atherogenesis (2004)
  • 著者名/発表者名: Sobue K. et al.
  • 雑誌名: International Congress Series 1262 ページ: 103-106
• [雑誌論文] MALS is a binding partner of IRSp53 at cell-cell contacts (2003)
  • 著者名/発表者名: Hori K.et al.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 554・1-2 ページ: 30-34
• [雑誌論文] Epiregulin as a major autocrine/paracrine factor released from ERK- and p38MAPK-activated vascular smooth muscle cells (2003)
  • 著者名/発表者名: Takahashi M. et al.
  • 雑誌名: Circulation 108・20 ページ: 2524-2529
• [雑誌論文] Vascular remodeling induced by naturally occurring unsaturated lysophosphatidic acid in vivo (2003)
  • 著者名/発表者名: Yoshida K. et al.
  • 雑誌名: Circulation 108・14 ページ: 1746-1752
• [雑誌論文] Synchronized formation and remodeling of postsynaptic densities : long-term visualization of hippo-camapal neurons expressing postsynaptic density proteins tagged with green fluorescent protein (2003)
  • 著者名/発表者名: Epihara T. et al.
  • 雑誌名: J.Neurosci. 23・6 ページ: 2170-2181
• [雑誌論文] Calcineurin-mediated pathway involved in the differentiated phenotype of smooth muscle cells (2003)
  • 著者名/発表者名: Ohokawa Y. et al.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 301・1 ページ: 78-83
• [雑誌論文] Synaptic targeting of PSD-Zip45 (Homer 1c) and its involvement in the synaptic accumulation of F-actin (2003)
  • 著者名/発表者名: Usui S.et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 278・12 ページ: 10619-10628