| 研究課題/領域番号 |
15H01833
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| 研究機関 | 早稲田大学 |
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研究代表者 |
鈴木 克彦 早稲田大学, スポーツ科学学術院, 教授 (80344597)
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| 研究分担者 |
秋本 崇之 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (00323460)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 運動 / 骨格筋 / 網羅的解析 / 老化 / マイクロRNA |
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| 研究実績の概要 |
本年度はマウス運動モデルの骨格筋サンプルを用いて、網羅的解析のためのライブラリーが構築できたことに加え、実際得られるシーケンスデータの解析パイプラインを構築でき、来年度のデータ解析に必要となる解析パイプラインを立ち上げることができた。具体的には、解析前処理として、受託先より得られるデータの品質精査、シーケンスアダプターの除去、リボソーム由来のリードの除去を行い、その後のステップとしてのパイプラインを構築し、高速マッパーであるBowtieにより前処理後のリードをマウスゲノムにマッピングし、RSEMを用いて既知のスプライシングバリアントに対してアセンブルを行い、EBSeqによってバリアント単位の変動発現を解析する。エキソンジャンクションを含むリードでも対応可能なTopHatにてマッピングを行い、CufflinksとCuffdiffを用いることで、新規遺伝子や未知のバリアントも発見し、変動遺伝子解析を行える。
また、老化に関してはC57BL/6J雄老化マウスモデル（24ヶ月齢）とC57BL/6J雄若齢マウス（16週齢）に中強度運動トレーニング（60分間/日）を週5日、6週間実施し、骨格筋をはじめいくつかの組織を採取した。次年度はこのマウスから採取したサンプルからRNAを抽出し、nCounter miRNA Expression Assayを用いてmiRNAの発現プロファイルを網羅的に解析する。複数組織での発現量の変動について、構造方程式を用いてその関連性について解析する。関連が認められたmiRNAについて、TaqManプローブを用いたリアルタイムPCRによりその発現を定量し、老化と運動とmiRNAの発現プロファイルの関連性を検討することを計画している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、網羅的な翻訳動態解析が可能なリボソームプロファイリングと網羅的転写動態解析を活用して、マウスの運動モデルにおいて運動トレーニングに対する骨格筋の適応メカニズムを網羅的見知から解明することを目的としている。本研究計画立案時は、骨格筋のみならず血液細胞や肝臓、脳、脂肪といった組織に対しても網羅的解析を行うことで、組織間のシステムレベルの作用機序解明を予定していたが、配分額では予算オーバーとなるため骨格筋の網羅的解析に的を絞ることとなった。
なお、平成27年7月にライブラリー作成キットが納品される予定であったが、生産量を上回る受注量があったためキットの生産が追いつかず、平成27年10月に納品された。そのため、実験の開始及び終了も3ケ月遅れることとなり、次世代シーケンス委託を平成28年4月に発注、次世代シーケンス委託データの納品が平成28年6月になることとなったため繰越申請を行ったが、それ以外はおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
運動トレーニングを行ったマウス骨格筋の網羅的データをもとに興味深い因子に的を絞り、C2C12筋管細胞を用いた機能解析を行うための基盤を整える。具体的には、網羅的解析により得られたデータからアダプター除去、リボソーム由来のリード除去を行った後、STARアライナーを用いてマウスゲノムにマッピングする。その後、RSEMにて既知のスプライシングバリアントに対してアセンブルし、EBSeqにてバリアント単位の変動発現を解析する。Cufflinksによるアセンブルも行うため、新規遺伝子や未知のバリアントも発見できる。上記解析パイプラインを、非運動群と運動群それぞれのPolyA mRNA／トータルRNA由来の転写動態データ、そして翻訳動態データに適応することで、転写動態変化に加えてPolyA mRNAの変化や翻訳動態変化を捉えることができる。そして、興味深い遺伝子等の機能解析を行うために、細胞を用いたノックダウンやオーバーエクスプレッションの基盤も構築する。
また、老化マウスから採取したサンプルからRNAを抽出し、nCounter miRNA Expression Assayを用いてmiRNAの発現プロファイルを網羅的に解析する。複数組織での発現量の変動について、構造方程式を用いてその関連性について解析する．関連が認められたmiRNAについて、TaqManプローブを用いたリアルタイムPCRによりその発現を定量する。これにより網羅的解析でリストアップされた分子の定量的な評価と妥当性の検証を行う。遺伝子・タンパク質の発現はリアルタイムPCR、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等にて評価し、細胞機能と細胞内外の情報伝達経路の連動について機序究明を目指す。
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