| 研究課題/領域番号 |
15H02042
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
杉山 正明 京都大学, 原子炉実験所, 教授 (10253395)
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| 研究分担者 |
加藤 晃一 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 教授 (20211849)
矢木 宏和 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 講師 (70565423)
井上 倫太郎 京都大学, 原子炉実験所, 准教授 (80563840)
藤井 紀子 京都大学, 原子炉実験所, 教授 (90199290)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | SAXS / SANS / 重水素化 / クラウド系 / クリスタリン / 逆転コントラスト同調法 |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質は生命現象を司る基本因子であり、その機能を理解するために静的・動的構造の研究が精力的に行われている。しかしながら、分子科学的な研究は結晶または希薄溶液中で行われており、実際にタンパク質が機能発現する細胞中＝多元高濃度系とは異なっている。そこで本研究は生体中に近い環境下でのタンパク質の構造を捉える手法を開発することを目的としている。つまり、「多種類」かつ「高濃度」の「タンパク質水溶液中」での「１つのタンパク質の構造」を測定手法の開発である。まず「水溶液中」での構造測定手法として本研究では「小角散乱法」を用いる。小角散乱法のプローブとしてはX線と中性子線があるが、本研究では両者の特徴を利用して相補的に使用する。Ｘ線小角散乱(SAXS)法は、高強度のシンクロトロン光を線源とすることで少量試料での短時間測定を可能とし、計算機を用いた解析手法の進歩とも相まって希薄溶液中でのタンパク質の外形を捉える手法として確立している。加えて近年は高精度光学系や高感度検出器の出現により実験室設置のSAXS装置でもタンパク質の溶液散乱が十分に可能となってきた。そこで、今年度は昨年素導入した最新の光学系と2次元半導体検出器を備えたSAXS装置の光学系の調整による測定領域の拡張を行った。タンパク質多元高濃度系での観測のキーポイントは「注目しているタンパク質のみを可視化し、それ以外のタンパク質を不可視にする手法開発」である。本研究では特に水素において大きい中性子散乱における同位体効果を利用し、タンパク質の精密部分重水素化と反転コントラストマッチング中性子小角散乱(iCM-SANS)を組み合わせて上記手法の確立を目指している。今年度は、水晶体内タンパク質クリスタリンの部分重水素化とそれを用いた「高濃度系」でのiCM-SANS測定に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究における重要なポイントは重水素化率を制御したタンパク質の調製手法の確立と高濃度クラウド系で測定技術の確率である。平成28年度は、平成27年度に終了した重水素化タンパク質調製系の立ち上げおよびそれを用いて75%重水素化タンパク質の調製法の展開を行った、これまではαBクリスタリンのみであったが、本年度はαAクリスタリンの重水素化も行いほぼ成功している。またαBクリスタリンに関しては大量精製も行った。更に調製した75%重水素化αBクリスタリンと軽水素化αAクリスタリンの混合系(単独系よりより生態系に近い)を用いたSANS測定をオーストラリアの中性子散乱研究施設(ANSTO)に設置されたSANS分光器(QUAKKA)およびフランスのラウエランジュバン研究所のSANS分光器(D22)を用いて逆転コントラストマッチング中性子小角散乱(iCM-SANS)測定を行った。その結果、この2元系では、前者からの散乱を消して後者からの散乱のみを観測することに成功し、この2元系におけるKineticsの解析を行った。
また、調製したタンパク質の基本構造測定のための集光光学系、低寄生散乱スリット、高感度大面積2次元半導体検出器を備えたX線小角散乱(SAXS)装置の整備・調製を進めた。
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| 今後の研究の推進方策 |
来年度は最終年度にあたるので、これまで集積した重水化技術を用いてより高濃度の苦クラウド系の構築を行い、クラウド系での逆転コントラスト同調法確立を目指す。特に、軽水素の非干渉性散乱がバックグラウンドとしてどの程度影響するかを厳密に評価する事が重要である。幸い、フランスのラウエランジュバン研究所の世界最高強度の中性子小角散乱装置での共同利用が採択されているので、ここでの測定を目指し、高効率試料調製技術の改良、溶媒条件のX線小角散乱装置を用いた検討を進める。また、逆転コントラスト同調法は他のタンパク質複合体にも適用し、これらの構造解析を進める。
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