| 研究課題/領域番号 |
15H02378
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
櫻井 実 東京工業大学, バイオ研究基盤支援総合センター, 教授 (50162342)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 乾燥保存 / LEAタンパク質 / トレハロース / コンピュータシミュレーション / ネムリユスリカ |
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| 研究実績の概要 |
Group3に属するLEAタンパク質(G3LEA)は、生物が乾燥耐性を獲得する際、必須のタンパク質であり、11個のアミノ酸(AKDGTKEKAGE)からなる繰返し配列を複数持つ。従来研究により、ネムリユスリカ由来のG3LEAの繰返し配列を2つ含む22残基ペプチド(PvLEA22)が、天然のG3LEAと同程度の機能をもつことが示されている。本研究では、このペプチドの乾燥保護機能のメカニズムを解明するため、以下の研究を行った。
1)ターゲットとしてリゾチームとHybDを選択し、PvLEA22とこれらターゲットとの間の相互作用を、コンピュータシミュレーションを用いて調べた。その結果、PvLEA22は、静電的に相補的な残基の側鎖をターゲットの方向に配向させることによって静電的引力を得て接近・結合するということが示された。また、エネルギー的には長距離では内部エネルギー駆動、近距離ではエントロピー駆動であった。比較のため、PvLEA22とアミノ酸組成が同一で配列を乱したScrambledペプチドについても同様のシミュレーションを行った。このペプチドについてもほぼ同様の結果が得られ、11-merの配列よりもむしろ組成が重要であることが示唆された。
2)in vitro実験により、PvLEA22は乾燥状態の酵素(LDHやBDG)の触媒活性を保持する機能があることが判明した。この機能は、乾燥保護剤としてよく知られているトレハロースより優れていた。
3) PvLEA22がin vivoでもin vitro系と同様に、タンパク質凝集抑制活性をもつかどうかを調べるため、このペプチドを恒常的に発現する細胞株を作成し、さらにその細胞の中にGFP-polyQを一過的に発現させた。蛍光顕微鏡観察により、PvLEA22発現細胞内では、有意にpolyQの凝集が抑制されることが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度当初計画に記した計画をほぼ100％近く達成できた。具体的には、以下の通り。
1) 哺乳類細胞内でLEAペプチドを発現し、アミロイド凝集抑制を観察することに成功したこと。
2) 細胞内混みあい状態を状態を想定した複数のタンパク質及びLEAペプチド混合系のシミュレーションを実行した。ただし、解析については現在進行中である。
3) LEAペプチドが乾燥状態において酵素の触媒活性機能を保護することを実証することに成功したこと。
4) LEAペプチドと細胞膜相互作用のMDシミュレーションから結合自由エネルギーを評価することに成功したこと。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、in vivoでの実験に本格的に取り組む。そのため、専門の知識を有する博士研究員を雇用する。
コンピュータシミュレーションに関しては、粗視化シミュレーションに重点を移し、乾燥状態でのPvLEA22-タンパク質間相互作用を明らかにし、分子シールディング仮説の妥当性を検証する。
in vitro実験に関しては、PvLEA22が酵素の4次構造を保持する能力があるのかどうかを詳細に調べる。その際、トレハロースとの比較も行い、両保護物質の特徴及び応用する際の”棲み分け”などを明確にする。さらに、乾燥状態でターゲットに結合しているときの、PvLEA22の構造についても、FTIR測定などに基づいて調べる。
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