研究課題
本研究は、細胞内情報処理蛋白質の多重リン酸化を利用した新たな細胞記憶の形成・保持機構を研究し、その分子機構に由来する細胞個性の発現や遺伝的変異による発病の理解を目指している。動物細胞の持つリン酸化酵素RAFは、細胞内情報処理ネットワークの要となる反応要素である。我々は最近、細胞内のRAF分子の平均構造が細胞ごとに異なっており、それが増殖因子に対する細胞ごとのRAFの応答性の違いと強く相関していること、さらに、RAFの構造分布が、分子内の複数のアミノ酸残基のリン酸化の組み合わせによって制御されていることを示す実験結果を得た。この結果は、各々の細胞が経験してきたリン酸化酵素活性化の履歴がRAF分子に埋込まれ、細胞応答を決定していることを示唆している。この現象の実態と意義を解明することが目標である。RAFの構造は、両端にGFPとTMR-Halo tagを結合したプローブ分子を用いて、末端間のFRET信号変化によって検出する。本年度は今後の研究へ向けた準備段階として、種々のリン酸化変異体を基にしたRAF構造検出プローブを作成し、また、photon counting histogramによる細胞内１分子構造分布計測装置を作成し、さらに、in vitroでの１分子構造変化計測系、長時間１細胞計測法などを開発した。様々な組み合わせでリン酸化部位に変異を持つ構造検出プローブの１細胞計測と、部位特異的なリン酸化の検出から、構造制御におけるリン酸化の上下関係・相関関係などが見えてきた。
2: おおむね順調に進展している
RAF分子内の３つのリン酸化部位(S259, S338, S621)の各々に対してリン酸化阻害、或いはリン酸化模倣する変異体、およびこれらの２重変異体の構造計測を行った。S259, S621のリン酸化、S338のリン酸化阻害はRAFの構造を閉じると共に、RAFの細胞膜局在を妨げて活性化に阻害的であるのに対し、S259、S621のリン酸化阻害、S338のリン酸化はRAFの構造を開き、RAFの細胞膜局在を促進した。２重変異体ではS621のリン酸化が支配的であり、リン酸化を阻害すると他の変位にかかわらずRAFの構造を開いて細胞膜局在させた。野生型および変異体プローブ分子のリン酸化を生化学計測したところ、S259のリン酸化酵素であるとされるAKTはむしろS621のリン酸化亢進作用が強く、野生型、変異体あるいは細胞に対するEGF刺激の有無を通じてS259とS621のリン酸化に強い相関が見出された。両者はいずれもRAFの構造を閉じて活性を阻害する作用があると考えられる。以上の結果は細胞全体から得られた、すなわち多数分子平均の発光スペクトル計測による。単一細胞内のRAF分子構造分布を得るため、共焦点光学系を利用して細胞質中の単一分子からのFRET信号を個別に計測するphoton counting histogram計測装置を組み立てた。予備的結果からは、平均構造は２ないし３状態の分布比の違いで決まっていると予想された。１分子FRET時系列から状態変化の計測を行うため、ガラス基板への蛍光蛋白質の固定法を検討し、非特異吸着を抑制して安定な計測が可能になった。また、単一細胞内のFRET時系列変化計測の方法を開発し、３日以上の連続計測で、細胞周期を越える長時間データ取得が可能になった。
本年度は研究計画の第一年目であり、種々の計測準備を行った。いずれもほぼ順調に進行し、次年度以降の本格的計測への十分な見通しが得られた。本研究ではRAFの分子記憶が多住リン酸化を通じて分子の構造へ埋め込まれ、それがRAFとRASあるいはRASを活性化・不活性化するリン酸化酵素分子、さらにRAFの基質分子との相互作用制御を通してMAPKシステムによる遺伝子発現制御に関わって、細胞運命を調節していると考える。この仮説を検証するため、次年度以降は、本年度に準備したプローブや開発した方法を利用して研究を進める。来年度は特に、細胞内１分子計測により、RAFの構造分布とその決定要因を明らかにすることが重要課題である。
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