| 研究課題/領域番号 |
15H02443
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
伏信 進矢 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (00302589)
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| 研究分担者 |
藤田 清貴 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 准教授 (20381189)
石渡 明弘 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (70342748)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 酵素 / タンパク質 / 有機化学 / 応用微生物 |
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| 研究実績の概要 |
我々はGH127およびGH146に分類されるβ-L-アラビノフラノシダーゼの結晶構造解析に成功し、その求核触媒が亜鉛に結合したCysであることを示した。これは糖質加水分解酵素では前例のない発見であったために、その反応機構についてはさらなる検証が必要である。本研究ではβ-L-アラビノフラノシド結合に作用する酵素の反応機構の詳細を明らかにするために、新規に開発する自殺基質や特異的阻害剤、反応中間体を模した擬似基質などを利用して構造機能解析を行った。
植物病原菌由来の酵素XCCの構造解析の結果、当初の予想に反し、全く機能未知の新規な糖質結合ドメインとみられる存在が明らかになった。研究遂行上、このドメインの機能をみきわめることが不可欠であることから、まず新規ドメインの機能解析を行った後に、基質アナログ合成および布告剛体構造解析を行った。0.5 % アラビノキシラン（ビーチウッドキシラン）、0.5 % ガムアラビナン、0.5 % 脱分岐アラビナンを用いてアフィニティーゲル電気泳動を行った。このうち、脱分岐アラビナンに関しては、相同酵素であるBT0349での活性が確認されている。アフィニティーゲル電気泳動の結果、コントロールとして用いたウシ血清アルブミンと移動度の変化が見られなかったため、XCCの新規ドメインはこれらの多糖には結合しないことが明らかとなった。このことから、この新規ドメインが糖質結合能力ではなく、基質結合部位を覆うことによるsteric hindranceの効果で基質特異性に関与していることが推察された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）アフィニティーゲル電気泳動などを用いて新規ドメインの糖質結合能の有無に関して一定の成果を得た。
２）HypBA1とL-アラビノフラノシルアミン誘導体を用いて阻害について解析を行った。まず動力学的解析によりBrAcNH-α-L-Araf （α-体）とBrAcNH-β-L-Araf （β-体）の両方で阻害を示すが、α-体の方が強い阻害を示すことが明らかになった。さらに、複合体の構造解析によりβ-体が活性中心と考えられるシステイン残基に共有結合していることが明らかになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
新規酵素XCCと合わせて、HypBA1を構造解析用酵素として今後用いる。化学合成したハロアミド体の阻害剤を用いて、阻害のkinetics（動力学的性質）を調べ、さらにソーキング（浸漬）法により、複合体の結晶構造解析を行い、共有結合阻害剤結合状態の原子分解能での構造を明らかにする。さらに、その構造から、システイングリコシダーゼの反応機構について新たな知見を得ることを目標とする。
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