| 研究課題/領域番号 |
15H02457
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
荒井 克俊 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 教授 (00137902)
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| 研究分担者 |
藤本 貴史 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 准教授 (10400003)
山羽 悦郎 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 教授 (60191376)
宗原 弘幸 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 准教授 (80212249)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 水産学 / 農林水産物 / 発生・分化 / 遺伝学 / バイオテクノロジー / 雑種 / クローン / 倍数体 |
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| 研究実績の概要 |
1.異種間受精と初期発生：異種間受精や遺伝操作のためには、卵の受精能を保持する必要があるので、ゼブラフィッシュでその条件を検討した。その結果、pH8.0のHanks液+0.5%BSAが最も良好な結果を示し、10-30分の間高い受精能を保持した。また、振盪による卵表面の洗浄も受精率向上に効果があった。サケマス類では、異種間受精と受精卵の高温処理による三倍体化を様々な組み合わせで実施した。サクラマス-アメマス間、カラフトマス-サクラマス間雑種および同異質三倍体は生存性で、浮上期をこえて生存した。ヒメマス-サクラマス間雑種では胚は孵化以前にほぼ全滅したが、高温処理群では孵化、浮上する個体があり、異質三倍体化による生存率回復がある程度見られた。ヒメマス-アメマス間、ヒメマス-オショロコマ間交雑は致死性であり、異質三倍体化による生存性回復は見られなかった。
2.非還元卵と雑種発生：自然クローン系統維持のため、北海道東部網走地方の3地点（st.1-3)および石川県七尾市5地点よりドジョウを採集した。北海道のst.1と3と石川県5地点では二倍体のみが生じたが、st.2では173尾中に三倍体17個体、二倍体-三倍体モザイク1個体がみられた。mtDNA、核DNAマーカーおよびRAPD-PCRによるDNAフィンガープリント分析の結果、st.1から22尾、st.2から5尾、st.3から2尾のクローン、石川県1地点から1尾のクローンを検出した。st.2の三倍体とモザイクはクローンと類似した遺伝子型を示した。これらの一部を飼育維持し、また交配実験に用いてFISHによる染色体分析、次世代シーケンサによる分析に供した。
3.半クローン生殖：半クローン生殖雑種と母系種との交配に由来するスジアイナメと通常のスジアイナメを区別可能なマーカー染色体を見出すことに成功し、機構解明に着手した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ゼブラフィッシュを母系種としてより効率的に異種間交雑や遺伝操作（染色体操作、胚操作など）を行うための、卵の受精能力を保持する条件を明らかにできた。また、サクラマス、カラフトマス、ヒメマス、アメマス等を用いてできるだけ多くの交雑実験を行い、雑種の生存性を明らかにするとともに、異質三倍体化の生存回復効果の存否を確認し、特殊な発生が生じているか否かの検討に着手できた。併せて、次年度の交配実験に向けた凍結保存精子の準備ができた。
飼育継代してきた自然クローンおよびその派生系統を強化するため、北海道東部および石川県野生集団より得たドジョウについて倍数性、核とmtDNAの遺伝学的分析からクローン、三倍体等の出現頻度を解明し、研究材料とすることができた。これらとその子孫を用いて、特殊なクローン生殖、減数分裂雑種発生が起こる時期の組織細胞学的、分子生物学的検討に着手するとともに、分離生殖細胞における発現RNAを採取することが可能となった。
自然のアイナメ類雑種は通常はクジメ雄との戻し交配で半クローン発生を維持するが、スジアイナメと交配すると純粋なスジアイナメとなる。この様な戻しスジアイナメと野生集団のスジアイナメを区別可能な染色体マーカー発見に成功し、半クローン生殖の細胞機構解明へのツールを得ることができたのは大きな前進であった。
以上より、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.異種間交雑と初期発生：受精能保持条件が解明できたので、これを用いて近縁種パールダニオ、遠縁種コイ等との異種間交雑を実施し、発生胚、ゲノム量、染色体を調べ、特殊な発生が生じているかを調べる。既に27年度に実施し、採集したサケ科魚類の異種間交雑に由来する標本について胚発生観察を行うとともに、DNAマーカーの分析を行い、特殊な発生が生じているか否かを解明する。保存した凍結精子による新規組み合わせによる交雑を行うほか、配偶子が入手できた場合は、キュウリウオ科においても交雑を実施する。
2.非還元配偶子等形成機構：ドジョウの種判別、系統判別、クローン判別に有効なマーカー開発を完成させ、系統を分子細胞遺伝学的に識別する反復配列DNAを用いたFISH法により、クローンゲノム中の異なる系統に由来する染色体を識別する。この手法により、別途、クローンあるいはクローン由来三倍体の生殖腺より、ステージ毎に分離した生殖細胞においてゲノム倍加およびゲノム削減が生じる細胞機構を明らかにする。ステージの異なる生殖細胞におけるde novo RNA-seq解析を用いて、ゲノム構成変化に応じて特異的に発現する候補遺伝子のスクリーニングと解析を実施する。
3.半クローン生殖の解析：アイナメ類雑種の生殖腺について、組織学的観察を加え、父系ゲノム削減の時期を推定する。また、ステージ毎の生殖細胞単離を行い、倍数性測定、染色体観察を試み、ゲノム削減におけるDNA量と染色体挙動を観察する。雑種の親種であることが推定されるアイナメ、クジメ、スジアイナメの染色体を識別する方法の開発に着手する。
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