| 研究課題/領域番号 |
15H02475
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
堀内 基広 北海道大学, 獣医学研究科, 教授 (30219216)
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| 研究分担者 |
小林 篤史 北海道大学, 獣医学研究科, 准教授 (50431507)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | プリオン / ミクログリア / アストロサイト / RNA-sequencing / 網羅的遺伝子発現解析 / 次世代シークエンサー |
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| 研究実績の概要 |
本課題は、神経細胞 (ニューロン) -グリア細胞のクロストークに焦点をあてた解析を進め、プリオン病における神経変性機構の分子機構の解明に迫ることを目的としている。平成28年度は、平成27年度のRNA-seqデーターで異常が認められた試料について、再度サンプリングからRNA-seqを行い、予定していた全サンプルのRAN-seqが終了したので、バイオインフォマティクスによる解析を行った。
RNASeqのデーターの信頼性を定量PCRにて確認した。ミクログリアではCXCL16, CCL6, CCL12, MHA_H2-K1, ARL5C, SPP1など、また、アストロサイトではTimp1, Thbs1, Serpina3n, Vegfaなどの発現の再現性が得られたことから、RANA-seqのデーターの質は保証できると思われる。
ミクログリアとアストロサイトで感染早期（接種後60日）から遺伝子発現変動を調べたところ、ミクログリアでは自然免疫に関する遺伝子の発現が上昇していたが、アストロサイトでは接種後60日で既に遺伝子発現変動が認められるものの、自然免疫に関与する因子の遺伝子発現には変化が認められなかったことから、プリオン感染の感染初期における自然免疫応答はミクログリアであることが示唆された。
また、アストロサイトにおける遺伝子発現の解析から、神経保護に働くアストロサイトでより活性化することが報告されているSTAT3シグナル経路の活性化が認められた。一方で、神経細胞とオリゴデンドロサイトを傷害するA1タイプと、神経保護的に働くA2タイプのアストロサイトに特徴的に発現するマーカー遺伝子の発現は、両方の遺伝子発現が上昇しており、どちらか一方に活性化している傾向は認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
RNA-Seqのデータの完全セットを取得して、Strand-NGSを用いた遺伝子発現変動を指標とした解析、およびIngenuity Pathway Analysisを用いて、細胞膜上のレセプター群を対象としたSensome解析、および分泌タンパク質を対象としたsecretome解析などの，バイオインフォマティクス解析を行い、ミクログリアおよぼアストロサイトそれぞれに、特徴的な傾向を見出した。ミクログリアでは、1)CXCL16, CCL6, CCL12, MHA_H2-K1, ARL5C, SPP1など、特徴的な遺伝子発現の変化を示す遺伝子を同定したこと、2)遺伝子発現パターンの異なる遺伝子群を2群に分類し、転写調節因子予測を行ったところ、それぞれの群で転写調節因子の利用パターンが大きくことなること、3)感染初期の自然免疫応答の主役はミクログリアであること、を見出した。アストロサイトでは、1)神経保護的に働くアストロサイトでより活性化しているとの報告があるSTAT3経路の活性化が認められたこと、2)神経細胞とオリゴデンドロサイトを傷害するA1タイプと、神経保護的に働くA2タイプの分類法は適応できないこと、などの進展があった。
また、今後培養細胞系でニューロンとグリアの相互作用を解析するための、プリオン感染初代神経培養の確立と、その基本的な性状の解析（異常型プリオンタンパク質産生の経時変化、シナプスタンパクの発現、細胞活性など）と、ニューロンの異常を検出するための画像データーの自動取得法を確立した。
以上のことから、研究はおおむね順調に進展していると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
バイオインフォマティクスの解析は継続が必要であるが、今後は、グリア細胞の機能を解析するための実験を進めていく。プリオン感染初代神経培養細胞とグリア細胞が直接接触するよう、分離したアストロサイト、ミクログリア、あるいはその両方を添加して培養する (直接共培養)、あるいはインサートウエルを介した間接共培養により共培養し、プリオン感染ニューロンに及ぼす影響を解析する。グリア細胞と共培養したプリオン感染マウス初代神経細胞に生じる変化は、1)神経細胞の樹状突起の長さと形態の解析、2) アポトーシスの有無(蛍光tunnel染色、および開裂caspase-3染色)の解析、 3)Synaptophysin, SNAP-25, PSD-95などのシナプスタンパク質、およびMAP2などの神経細胞マーカー分子の発現量と分布の解析、4) Grp78, Grp58など小胞体ストレスマーカーとして汎用される分子の発現を指標としたUnfolding Protein Responseの解析、5) ミトコンドリアの形態と機能の解析、などにより解析する。
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