| 研究課題/領域番号 |
15H02480
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
長嶋 比呂志 明治大学, 農学部, 専任教授 (50318664)
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| 研究分担者 |
大鐘 潤 明治大学, 農学部, 専任准教授 (50313078)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ブタ / 遺伝子改変動物 / 常染色体優性遺伝病 / ハプロ不全 / マルファン症候群モデル / エピジェネティクス / CpG shore / メチル化修飾 |
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| 研究実績の概要 |
ハプロ不全として定義されている優性遺伝病の発症機序を明らかにするために、マルファン症候群モデル動物であるFibrillin 1遺伝子（FBN1）変異ブタを作出し、ヘテロ変異個体およびホモ変異個体の表現型（病態）の解析を実施した。
正常FBN1と変異FBN1のそれぞれのプロモーター領域のメチル化状態を確認するため、FBN1プロモーターCpG shore内のSNPを指標に判別できるヘテロ変異個体を得た。一部のヘテロ変異個体からマルファン症候群と関連していると推測される表現型が得られた。さらに、プロモーターCpG shoreにSNPを有するFBN1ヘテロF1個体について、新生仔の尾部よりFBN1を高発現する繊維芽細胞を樹立した。プロモーターSNPの確認が取れたヘテロ欠損細胞株について、バイサルファイトシーケンス法により正常・変異アリルを区別したDNAメチル化解析を行った。その結果、正常アリルCpG shoreの低メチル化アリル割合とFBN1 mRNA量が正に相関することが示唆された。
FBN1の発現量がヘテロ個体とホモ個体の中間となる個体の作出を目的としたRNA干渉ベクターを作製した。ブタ線維芽細胞でのin vitro試験では、FBN1 mRNAがノックダウンしている事が確認出来た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
正常FBN1アリルと変異FBN1アリルとの識別が可能なヘテロ変異個体が得られ、一部のヘテロ変異個体からマルファン症候群と関連していると推測される表現型が得られた。さらに、プロモーターCpG shoreにSNPを有するFBN1ヘテロF1個体より得られた尾部繊維芽細胞について、正常・変異アリルを区別したDNAメチル化解析を行った。その結果、正常アリルCpG shoreの低メチル化アリル割合とFBN1 mRNA量が正に相関することが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
各アリルのFBN1プロモーターCpG shoreに一塩基多型（SNP）を有するFBN1変異F1個体群を作出した。これらの個体を継続飼育し、病態発現動態を追跡調査すると同時に、適宜採材を実施し、正常・変異アリルを区別したFBN1 CpG shoreのDNAメチル化解析を実施する。さらに、昨年度樹立したプロモーターCpG shoreのSNPを利用して正常・変異アリルを区別できる新生仔線維芽細胞を用いて以下の実験を行う。FBN1変異によるマルファン症候群は生後の成長過程で発症する例が多く見られることから、樹立した線維芽細胞の継代過程でのアリルを区別したプロモーターCpG shoreでのDNAメチル化解析を行い、継代に伴いDNAメチル化の亢進による遺伝子発現変化が見られるか検討する。また、プロモーターCpG shoreでの正常アリルのDNAメチル化度合いと異常RNA分解前の前駆RNA量および成熟mRNA量の相関を検討し、正常アリルの偶然のDNAメチル化変化がマルファン症候群発症のきっかけとなりうる正常アリル由来の成熟mRNA量の変化に結びつくかどうかを検討する。
FBN1の発現量がヘテロFBN1変異個体とホモFBN1変異個体の中間となる個体の作出を試みる。ブタ線維芽細胞でのin vitro試験では、短ヘアピンRNA（short hairpin RNA; shRNA）の発現により、FBN1 mRNAがノックダウンしている事が確認出来た。本年度では、本ベクターとヘテロFBN1変異雄性個体から得た精子を用いて、Intracytoplasmic sperm injection-mediated gene transfer（ICSI-MGT）により目的の個体を作出し、安定的に病態を発症するが新生仔致死に至らない病態モデルブタとなるのか検証する。
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