| 研究課題/領域番号 |
15H02489
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
川崎 努 近畿大学, 農学部, 教授 (90283936)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 植物免疫 / 受容体 / RLCK / MAPKKK / MAPK |
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| 研究実績の概要 |
植物の細胞膜上には数百以上の受容体が存在し、細胞外に存在する病原菌、ホルモン、分泌ペプチドを検知し、その情報を細胞内に伝達することで、防御応答や形態形成など様々な生体反応を誘導している。このような多くの受容体によって活性化される細胞内の信号伝達において、MAPKカスケード(MAPKKK- MAPKK- MAPKの3種のタンパク質リン酸化酵素により構成される信号伝達経路)が主要な働きをしていることが知られているが、植物では受容体からMAPKカスケードに至る信号伝達機構については報告されていない。我々は、シロイヌナズナの細胞膜上に存在するキチン認識受容体CERK1がキチンを検出後、受容体型細胞質キナーゼであるPBL27を直接、リン酸化することにより、情報を細胞内に伝達すること、さらに、PBL27が、キチンに応答したMAPKの活性化を制御していることを明らかにした。そこで、PBL27によるMAPKカスケードの活性化機構を解明するため、PBL27と相互作用するMAPKKKを探索し、MAPKKK5を同定した。MAPKKK5の機能欠損変異体では、キチンに応答したMAPKの活性化が抑制されていることから、MAPKKK5がPBL27の下流でMAPKの活性化を制御していることが明らかになった。さらに、酵母Two Hybridおよびin vitroリン酸化解析の結果、PBL27は、MAPKKK5のC末端領域に直接的に相互作用し、リン酸化することが明らかになった。さらに、PBL27によってリン酸化される６個のアミノ酸残基を特定し、それらのアミノ酸残基がキチンに応答したMAPKの活性化に必要であることを証明した。また、PBL27とMAPKKK5の細胞内相互作用をBiFC法を用いて解析し、これらのタンパク質が細胞膜上で相互作用していることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
MAPKKK5の発現量が非常に低く、細胞内のMAPKKK5のタンパク質を解析することに困難が予測されたが、シロイヌナズナのプロトプラストやタバコ葉を用いた一過的発現系の技術を習得し、MAPKKK5の細胞内局在およびPBL27との相互作用を解析することに成功した。また、PBL27によってリン酸化されるアミノ酸残基をアラニンに置換した変異タンパク質の発現により、MAPKKK5機能欠損変異が完全に相補されないことが明らかとなり、PBL27によるMAPKKK5のリン酸化が、キチンに応答したMAPKの活性化に必須であることを遺伝学的に証明することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の研究成果により、PBL27によってリン酸化されるMAPKKK5の6個のアミノ酸残基がMAPKKK5の活性化に重要であることを示した。そこで、個々のアミノ酸残基をアラニン置換した変異体を作製し、in vitroリン酸化実験により、個々のアミノ酸残基がPBL27によってリン酸化されるレベルを定量的に解析する。さらに、強くリン酸化されるアミノ酸残基がMAPKKK5の活性化にどの程度、重要であるかを明らかにするために、アラニン置換した変異遺伝子をMAPKKK5変異体に導入し、キチンに応答したMAPKの活性化を解析する。
in vitroリン酸化解析により、PBL27はMAPKKK5のC末端領域のみのタンパク質をリン酸化することができるが、全長のMAPKKK5をリン酸化することができない。しかし、植物体を用いた遺伝学的解析により、細胞内ではPBL27が全長のMAPKKK5をリン酸化していると考えられる。このことから、CERK1によってリン酸化されたPBL27が、MAPKKK5をリン酸化できる可能性が示唆されるため、それを実験的に証明する。
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