| 研究課題/領域番号 |
15H02560
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
淺原 弘嗣 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (70294460)
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| 研究分担者 |
森 雅樹 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, プロジェクト講師 (10602625)
乾 雅史 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, システム発生・再生医学研究部, 室長 (20643498)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | Mkx / 腱・靱帯 / 運動器 / GTF2IRD1 |
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| 研究実績の概要 |
運動器は、筋と骨・軟骨が腱・靱帯によって正確かつ強靭に結ばれることで機能を発揮するが、腱・靱帯の発生研究、再生医療は十分に進展していない。
本年度は、我々の同定した腱・靭帯に特異的な転写因子Mkxの腱・靭帯組織の発生と維持に必須の機能とそのメカニズムを解明し、Mkxを用いた幹細胞からの腱・靭帯再生研究を行った。特に、MkxノックアウトラットをCRISPR/Cas9を用いて作成し、そのフェノタイプを解析したところ、アキレス腱が異所性骨化を起こすことを見出した。Mkxノックアウトラットにおいて、歩行解析を行ったところ、足関節の可動域に異常を認めた。このメカニズムとして、マイクロアレイおよびChIP(クロマチン免疫沈降)-シークエンスを組み合わせた実験結果の解析より、Mkxが腱に必要な遺伝子発現を促すだけでなく、骨化に関わる遺伝子の抑制制御を同時におこなっている可能性が示唆された。また、in vitroでのメカニカルストレスの実験系により、野生型の腱細胞は、メカニカルストレスに応答して、腱に必要な遺伝子群の促進のみが起こるが、Mkxを欠損した腱細胞では、腱関連遺伝子の促進は起こらず、代わりに、Sox9など骨・軟骨関連遺伝子の発現が促進することが示された。
これを基に、脊椎椎間板の発生と維持にも、Mkxが重要であることをを示し、さらに、Mkxを用いた、椎間板変性の治療への応用の可能性を、モデルマウスを用いた実験で示すことができた。
以上により、Mkxには腱を保持し、腱以外の組織への間違った分化を抑制する2面があり、これによって、腱・靭帯の恒常性が保たれることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
今回、遺伝子編集技術であるCRISPR/Cas9システムを導入することで、ラットのMkx遺伝子を改変することに成功し、マウスでは困難であった研究を進めることができた。Mkxが欠損すると全身の腱が脆弱になっていることがわかった。ノックアウトラットをさらに詳細に解析すると、出生後まもなくアキレス腱が骨化することが明らかになった。このメカニズムとして、腱細胞に対する機械的な伸展刺激が、Mkxという遺伝子スイッチを押すことで、腱・靭帯を守り、骨化を妨げることが示唆された。さらに、このノックアウトラットから得られた十分量の腱細胞を用い、クロマチン免疫沈降と次世代シークエンサーを組み合わせた研究手法によって、腱を再生し維持する遺伝子のプログラムを詳細に明らかにした。さらにこれらのツール、情報をもとに、歯根膜や椎間板におけるMkxの重要性やこれら組織の再生・再建医療における新しい知見を得ることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
1． iPS細胞からMkx陽性細胞の誘導法の確立。
ヒトおよびマウスiPS細胞を作成し、これを用いて、間葉系の細胞を誘導、さらにMkxを導入することで、腱細胞の誘導方法を確立する。腱・靭帯に必須もしくは特異的な遺伝子の発現やその後の分化能について以下の解析をする。①iPS細胞へのMkxの導入による細胞形態の変化を観察する②腱・靭帯に必須、特異的あるいは必須の遺伝子発現、COL1A1, TNXB, TNMD等の発現変化を解析する。③Mkx導入細胞における軟骨、骨、脂肪細胞への分化能を抑制する効果を検討する。同時に、ヒト間葉系幹細胞においても、アデノウイルスを用いてMkxを過剰発現させ、同様の検討を行う。さらに、スカフォールドと進展装置を用いたin vitroでの3次元構造の中での分化誘導で、iPS細胞、間葉系幹細胞から誘導された腱細胞の腱・靭帯形成能を組織学的に検証する。
2．Mkxのエンハンサーを制御する分子群の解析
Mkxを制御する転写因子および上流シグナルを探索する目的で、エンハンサーをLucにつないだレポーターを用いて、ほぼ全てのヒト遺伝子を網羅した2万のcDNA発現ベクターを293T細胞にコトラスフェクションする細胞ベースのノンバイアスハイスループットアッセイを行い、それら候補遺伝子の発現や機能を探索することで、Mkxを制御する分子群を同定する。昨年までに、上流7kにLucをつないだレポーターを用いて、5000遺伝子のスクリーニングを行ったところ、ETS2, GTF2IRD1, HOXC11等が同定され、これら遺伝子をMkxの上流シグナルの候補遺伝子と考えている。さらにこれらの詳細な役割とメカノシグナルとの関連について検討する。
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