研究課題
本研究は、放射線によって生じる種々のDNA損傷の中で最も重篤と考えられるDNA二重鎖切断(DSB)のセンサー分子、DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の機能を明らかにすることを目的として行った。平成27年度は、(1)DNA-PKの新規リン酸化部位の探索、新規リン酸化プローブ(リン酸化状態特異的抗体)の作製、(2)リン酸化の意義を探るための細胞内、試験管内のDNA損傷応答およびDNA修復実験系の構築を当初計画した。(1)に関しては、これまで6種類のリン酸化状態特異的抗体を作製しているXRCC4について、新たに１種類作製した。さらに、XLF、DNA ligase IV、Ku70、Ku86の新規リン酸化部位の網羅的探索を当初予定していた。しかしながら、平成27年に新たなNHEJ分子PAXXが3つのグループから報告されたことを受け、DNA-PKによるPAXXのリン酸化について検討を行った。その結果、DNA-PKがPAXXをリン酸化することが明らかになり、リン酸化部位の同定に向けて候補部位の絞り込みを行った。(2)に関しては、平成27年に5つのグループからXRCC4欠損患者の症例が相次いで報告された。予想外のことに、XRCC4欠損マウスや他のNHEJ関連分子欠損患者と異なり、免疫不全は見られなかった。そのうち多くの症例で、リン酸化部位を含む領域の欠損が見られたことから、リン酸化と病態との関連を探ることは重要と考えた。そこで、XRCC4欠損患者細胞と他のNHEJ関連分子欠損患者細胞を入手するとともに、CRISPR/Cas9システムを用いてこれらの遺伝子欠損細胞の作製を行った。さらに、さまざまな患者の変異を模擬したXRCC4 cDNAを作製し、XRCC4欠損細胞に導入して、機能解析を行った。また、スウェーデン・カロリンスカ研究所のPan-Hammarstrom教授グループとの共同研究で、抗体遺伝子のクラススイッチ組換えにDNA-PKcsおよびそのリン酸化機能が重要であることを明らかにした。
2: おおむね順調に進展している
上記のように、平成27年には、本研究に密接に関わる大きな進展があった。一つは、新たなXRCC4、XLF関連分子PAXXの発見、もう一つは、XRCC4欠損患者の報告である。これらに対応して研究の進め方を見直した。リン酸化状態特異的抗体作製については、XRCC4について1種類をまず作製した。PAXXについては現在、リン酸化部位の絞り込みを進めているが、リン酸化部位同定、リン酸化状態特異的抗体が作製できれば新規性、有用性が高いと考えられる。また、DSB修復実験系については、相同組換えについては測定系が確立しているが、NHEJの測定系の確立が難航した。DNA-PKcs、XRCC4などの機能を反映する実験系が、現時点では構築できておらず、この部分に関しては、当初計画通りには進まなかった。一方で、XRCC4の欠損患者の報告を受けて、さまざまな患者の変異を模擬したXRCC4 cDNAを作製し、XRCC4欠損細胞に導入して安定発現株を樹立した。さらに、種々の放射線高感受性遺伝病患者の細胞が入手できたことや、海外グループとの連携ができたことは今後の研究を進めて行く上でも極めて有意義である。この部分に関しては、当初予想以上の成果が得られた。このように当初計画通りに進まなかった部分と、当初予想以上の成果が得られた部分があり、総合的にみれば、概ね計画通りの進捗状況と考えている。
XRCC4欠損遺伝病に関する知見、種々の放射線高感受性遺伝病患者の細胞をうまく活用し、分子、細胞レベルのみならず、組織、個体レベルでのリン酸化の意義に結びつくように研究を進めたい。海外グループとの連携も活用し、さらに広げていきたい。NHEJの測定系の確立が難航したのは、DNA-PKcs、XRCC4が関わるC-NHEJ (classical NHEJ)と、A-NHEJ (alternative NHEJ)の識別が困難なためと思われる。A-NHEJの抑制なども試みているが、現時点では成功していない。V(D)J組換え実験系を導入することとし、遺伝子組換え実験申請などの準備を進めている。平成28年度は2年目にあたるので、平成27年度以上の国際・国内学会発表に加え、論文投稿を行っていきたい。
すべて 2016 2015 その他
すべて 国際共同研究 (3件) 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 2件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (6件) (うち国際学会 2件、 招待講演 4件) 備考 (1件)
Medical Molecular Morphology
巻: 印刷中 ページ: 印刷中
10.1007/s-00795-016-0136-5
Journal of Immunology
巻: 195 ページ: 5608-5615
10.4049/jimmunol.1501633
http://www.nr.titech.ac.jp/~yoshim/matsumotos_lab/Home.html
