| 研究課題/領域番号 |
15H02837
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
佐藤 令一 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (30235428)
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| 研究分担者 |
天竺桂 弘子 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 講師 (80434190)
菊田 真吾 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (90718686)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | Bacillus thuringiensis / 進化分子工学 / Cry毒素 / ファージディスプレイ / 殺虫性タンパク質 / オーガニック殺虫剤 / Bt |
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| 研究実績の概要 |
①活性の改善と活性の創生を可能にする進化分子工学モデルの構築：まず、カドヘリン受容体を用いたパニング選抜系の立て直しを実施し、再構築に成功した。そこで、次に、ABCC2に対するパニング選抜系の構築を目指し、カイコガのABCC2分子の大量精製法を検討した。Sf9/Baculovirus発現システムでは5リットルレベル培養でも十分な量を得ることができなったので、カイコガ蛹/Baculovirus発現システムを使った委託生産を試み、mgレベルに迫ると思われる高い生産が実現できたので、抗FLAG Tag抗体ゲルによるアフィニティー精製法の検討に入った。②カイコを殺す各種殺虫性タンパク質が使う消化管細胞上の受容体分子の解析：カイコを殺す殺虫性タンパク質、Cry1Ca、Cry1Da、Cry2Aa、Cry9DaがCry1Aaと同様にBmABCC2とBmABCC3を使って細胞を殺せるかを調査した。しかし、予想に反してどれもこれら２種の分子を受容体にできるものはなかった。しかし、逆に、これらの毒素もBmABCC2を対象として結合性を獲得させ、活性を高めるモデルに使えることが明らかになった。③リアルタイムPCRによるBmABCC2とBmABCC３の消化管における発現レベル解析：カイコガ幼虫各齢の消化管細胞におけるBmABCC2とBmABCC3の発現レベルを比較解析した。両者の発現量には大きな差はなく、結合特性に由来する受容体機能の違いのせいでBmABCC2がカイコガ幼虫のCry1Aaに対する感受性を決定する主要な分子になっていることが推定された。④Cry1Aa１毒素上のBmABCC2結合部位解析：より効果的なライブラリー作製戦略確立のためにCry1Aa１毒素のBmABCC2結合部位の概要を解析し、ループ部位が結合の中心的な場所であることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①活性の改善と活性の創生を可能にする進化分子工学モデルの構築に関しては目標としたパニング選抜系の完成までは到達できなったが、その目前のパニング対象分子BmABCC2の大量生産系までは完成した。ところで、②カイコを殺す各種殺虫性タンパク質が使う消化管細胞上の受容体分子の解析と③リアルタイムPCRによるBmABCC2とBmABCC３の消化管における発現レベル解析に関してはほぼ目標を達成した。すなわち、当初予定した研究はおおむね消化でき、期待通りのペースで進んでいる。一方、当初は今年度の実施は考えていなかった④Cry1Aa１毒素上のBmABCC2結合部位解析にも着手し、大きな成果を得ることができた。よって、むしろ当初の計画以上ともいえるレベルで、研究はおおむね順調に進展していると言える
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は、一方で、体系的にBT殺虫性タンパク質が受容体として使える分子を解明し、更には「受容体として使えるとはどのような関係性にあることか」を解析するといった基盤研究を行う。また、他方では、受容体を固定化したプレートで変異体殺虫性タンパク質を提示したファージをスクリーニングする、「進化分子工学のシステム作り」を試み、トータルで「BT菌が進化の過程で成し遂げてきた様々な殺虫性タンパク質作出を真似た人為的な『新殺虫性タンパク質作出』の方法を構築しよう』とするものである。ところで、前者の基盤研究の結果から当初のプランを越したより効果的な『新殺虫性タンパク質作出方法の案』が見えて来た。すなわち、結合性が向上した変異体を効率的に生み出すためのBT殺虫性タンパク質への変異導入場所に関する知識においてこれまでにないものが得られたので、これに関してさらに詳細に調査して、より容易に新殺虫性タンパク質が作出できる方向へとこの研究を展開させたい。
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