多機能ナノピペット探針の電気化学的物質輸送制御と１細胞分析への応用

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H03542
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 珠玖 仁 東北大学, 工学研究科, 教授 (10361164)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 走査型プローブ顕微鏡 / １細胞分析 / 遺伝子発現 / 分化 / 液液界面

研究実績の概要

近年、１細胞分析が高感度化・ハイスループット化し、大腸癌患者の実組織試料を用いて、１細胞レベルでの網羅的遺伝子発現解析が報告されている。しかし現行法では、組織試料から1細胞分析を行う際には高性能セルソーターによる細胞分取が不可欠であり、組織試料の中での細胞個々の位置情報が失われてしまう点が問題であった。本研究では、走査型プローブ顕微鏡により組織モデルの高解像度画像を取得し、標的細胞から低侵襲的に極微量サンプルを高精度に回収して網羅的遺伝子発現解析をおこなう装置システムの開発を目的とする。
１．並列PCRと核酸タグ・インジェクション法：mRNAを捕捉する際に用いられるポリT配列プライマーに配列長100塩基分のインデックスを連結した核酸タグを合成し、１細胞ごとに蛍光色素と種類の異なる核酸タグを同時にインジェクションする系を検討した。電気化学シリンジの原理を応用し、水相と有機相を1本のピペット内に積層する方式（ミルフィーユ探針）により、インジェクションおよびmRNAの捕捉の作業効率向上を検討した。有機相の電解質濃度を最適化し操作の再現性を高めた。複数細胞種の同時遺伝子解析を実施した。ミルフィーユ探針内に複数種類の核酸タグが混在している場合でも、マーカー遺伝子の同時検出が可能であることを定量PCRにより確認した。
２．イメージングの最適化：2ch多機能ナノピペット探針を用い、高分解能SICM像を取得した後、指定したアドレスにおけるサンプルの微量回収が効率的に行えるよう回収工程を確立した。SICM画像は、水相チャネルのみならず、有機相チャネルのイオン電流をフィードバック信号に用いた場合でも取得可能であることが分かった。SICM用探針の電解質濃度や探針口径を変化させ、画像取得条件を検討した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

精製したRNAの代わりに細胞質に対して核酸タグを作用した場合にmRNA回収効率が低下した。ナノピペットを用いた核酸タグのインジェクションは、細胞回収と較べ操作条件が厳しいことが判明した。予定より多くの条件を最適化する必要が生じた。ナノピペット探針を駆動するための電気化学シリンジの基本原理や動作特性についても、電解質や核酸濃度の影響を考慮し幅広く条件を検討する必要が生じた。

今後の研究の推進方策

電気化学シリンジを用いる実験系では、2ch多機能ナノピペット探針に加え、よりシンプルな系として1chの油/水界面ナノピペットプローブを使用することにより、基礎的な動作特性を詳細に取得することを検討する。蛍光分子を標識に用いて、試料への蛍光分子のインジェクションを確認する。電気化学シリンジを用いた遺伝子発現解析では、細胞を単層状に播種した場合と細胞塊を試料として実験系を構築する。細胞に対するダメージを減らすためにイオン分布やイオン電流の解析を検討する。サンプルリザーバーを設計・作製することにより、SPM画像取得時の任意の座標における細胞試料を回収しリザーバーの各アドレスに吐出する操作の自動化を検討する。多機能ナノピペットの応用例として、電気化学シリンジに加えて走査型電気化学顕微鏡-走査型イオンコンダクタンス顕微鏡(SECM-SICM)による形状、電気化学活性の同時画像化も検討する。

研究成果

• [雑誌論文] Continuous collection and simultaneous detection of picoliter volume of nucleic acid samples using a mille-feuille probe (2017)
  • 著者名/発表者名: Ito Hidenori、Tanaka Motoki、Zhou Yuanshu、Nashimoto Yuji、Takahashi Yasufumi、Ino Kosuke、Matsue Tomokazu、Shiku Hitoshi
  • 雑誌名: Anal. Bioanal. Chem. 巻: 409 ページ: 961～969
  • DOI: 10.1007/s00216-016-0006-y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Three-dimensional co-culture of C2C12/PC12 cells improves skeletal muscle tissue formation and function (2017)
  • 著者名/発表者名: S. Ostrovidov, S. Ahadian, J. Ramon-Azcon, V. Hosseini, T. Fujie, P. P. Selvakumar, H. Shiku, T. Matsue. H. Kaji, M. Ramalingam, H. Bae, A. Khademhosseini*
  • 雑誌名: J. Tissue Eng. Reg. Med. 巻: 11 ページ: 582-595
  • DOI: 10.1002/term.1956
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cell Sheet Fabrication Using RGD Peptide-Coupled Alginate Hydrogels Fabricated by an Electrodeposition Method. (2017)
  • 著者名/発表者名: F. Ozawa, K. Ino,* Y. Takahashi, H. Shiku, T. Matsue*.
  • 雑誌名: Chem. Lett. 巻: 45 ページ: 605-608
  • DOI: 10.1246/cl.170003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Binary number-based digital electrochemical detection using a single working electrode with multiple sensors. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kosuke Ino, Yusuke Kanno, Yuta Yamada, Hitoshi Shiku, Tomokazu Matsue
  • 雑誌名: Electrochem. Commun. 巻: 77 ページ: 76-80
  • DOI: 10.1016/j.elecom.2017.02.016
  • 査読あり
• [雑誌論文] Scanning Probe Microscopy for Nanoscale Electrochemical Imaging. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yasufumi Takahashi, Akichika Kumatani, Hitoshi Shiku, Tomokazu Matsue.
  • 雑誌名: Anal. Chem. 巻: 89 ページ: 342-357
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.6b04355
  • 査読あり
• [雑誌論文] An approach to the research on ion and water 1 properties in the interphase between the plasma membrane and bulk extracellular solution. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi HIBINO, Madoka TAKAI, Hidenori NOGUCHI, Seishiro SAWAMURA, Yasufumi TAKAHASHI, Hideki SAKAI, and Hitoshi SHIKU
  • 雑誌名: Journal of Physiological Sciences 巻: 67 ページ: 439-445
  • DOI: 10.1007/s12576-017-0530-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Evaluation of mRNA Localization Using Double Barrel Scanning Ion Conductance Microscopy (2016)
  • 著者名/発表者名: Nashimoto Yuji、Takahashi Yasufumi、Zhou Yuanshu、Ito Hidenori、Ida Hiroki、Ino Kosuke、Matsue Tomokazu、Shiku Hitoshi
  • 雑誌名: ACS Nano 巻: 10 ページ: 6915～6922
  • DOI: 10.1021/acsnano.6b02753
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sequential Monitoring of Oxygen Consumption Rate of Mouse Embryo Bodies in Glucose-Depleted Solution. (2016)
  • 著者名/発表者名: H. Shiku*, N. Aoki, T. Arai, Y. Zhou, K. Y. Inue, K. Ino, T. Matsue*.
  • 雑誌名: Electrochemistry 巻: 84 ページ: 302-304
  • DOI: 10.5796/electrochemistry.84.302
  • 査読あり
• [雑誌論文] Redox cycling-based electrochemical reporter gene assay for single cells using a scanning electrochemical microscope-microwell system. (2016)
  • 著者名/発表者名: H. Ida, K. Ino, J. Suzuki, Y. Kanno, H. Shiku, T. Matsue*.
  • 雑誌名: Electrochemistry 巻: 84 ページ: 308-311
  • DOI: 10.5796/electrochemistry.84.308
  • 査読あり
• [雑誌論文] Electrochemical imaging for single-cell analysis of cell adhesion using a collagen-coated large-scale integration (LSI)-based amperometric device. (2016)
  • 著者名/発表者名: H. Abe, Y. Kanno, K. Ino,* K. Y. Inoue, A. Suda, R. Kunikata, M. Matsudaira, H. Shiku, T. Matsue *,
  • 雑誌名: Electrochemistry 巻: 84 ページ: 364-367
  • DOI: 10.5796/electrochemistry.84.364
  • 査読あり
• [雑誌論文] Electrochemical Hydrogel Lithography of Calcium-Alginate Hydrogels for Cell Culture (2016)
  • 著者名/発表者名: Ozawa Fumisato、Ino Kosuke、Shiku Hitoshi、Matsue Tomokazu
  • 雑誌名: Materials 巻: 9 ページ: 744～744
  • DOI: 10.3390/ma9090744
  • 査読あり
• [学会発表] Electrochemical micro- and nano-analysis of embryos and embryonic stem cells, (2016)
  • 著者名/発表者名: Hitoshi Shiku
  • 学会等名: Tohoku University's Chemistry Summer School 2016
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Scanning probe microscopy for high-resolution and multi-functional images (2016)
  • 著者名/発表者名: Hitoshi Shiku
  • 学会等名: 平成28年度化学系学協会東北大会
  • 招待講演
• [学会発表] センシング技術による細胞機能評価 (2016)
  • 著者名/発表者名: 珠玖 仁
  • 学会等名: 第39回 教師のための化学教育講座
  • 招待講演