| 研究課題/領域番号 |
15H03826
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
山中 正道 静岡大学, 理学部, 准教授 (10377715)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ゲル / 自己集合 / 電気泳動 / 超分子 / タンパク質 / 核酸 |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質や核酸類などの生体高分子の分離分析手法として、ゲル電気泳動は広く利用される分析技術である。電気泳動における支持体であるゲルに着目したとき、ポリアクリルアミドまたはアガロースが用いられることが多く、それ以外の支持体を用いた電気泳動の報告例は皆無に等しかった。我々は、生体高分子の電気泳動における新規な支持体として、超分子ヒドロゲルに着目した。低分子ヒドロゲル化剤の水中での自己集合により形成する、超分子ヒドロゲルは、分子設計に応じ様々に機能化することができる。そのため、超分子ヒドロゲルを支持体とした電気泳動法の確立は、生体高分子の分離分析手法の新機軸となり得る。我々はこれまでに、超分子ヒドロゲルを支持体とした、変性タンパク質および酸性未変性タンパク質の電気泳動法の開発を達成している。これらを基盤とし、本研究では、変性タンパク質の超分子ヒドロゲル電気泳動における界面活性剤の濃度効果、超分子ヒドロゲルを支持体とした塩基性未変性タンパク質の電気泳動法の開発、超分子ヒドロゲルを支持体とした核酸類の電気泳動法の開発を実施する。また、これらの検討と並行し、電気泳動の支持体としてより適切な素材開発を目的に、既存のポリアクリルアミドやアガロースと比較し、同等の強度を有する超分子ヒドロゲルの開発を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度は、超分子ヒドロゲルを支持体とした変性タンパク質の電気泳動における界面活性剤の濃度効果に関する研究を達成し、超分子ヒドロゲルを支持体とした塩基性未変性タンパク質の電気泳動、および超分子ヒドロゲルを支持体とした核酸類の電気泳動に関する端緒となる成果を得た。
親水基として糖を有する両親媒性トリスウレア分子は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などのイオン性界面活性剤を含む水溶液をゲル化する。この超分子ヒドロゲルを支持体とした変性タンパク質の電気泳動では、45 kDaを境界に、大きな分子量のタンパク質では小さなタンパク質が大きな移動度を示し、小さな分子量のタンパク質では大きなタンパク質が大きな移動度を示すという特異的な分離様式を見出している。また、界面活性剤濃度がゲルを構成する繊維状集合体形成に影響するという知見より、電気泳動における界面活性剤濃度が、分離様式が変化する境界となるタンパク質の分子サイズに影響を及ぼすと考え、種々のSDS濃度における変性タンパク質の電気泳動を検討した。その結果、SDS濃度が1.0 mMのとき分離様式が変化する境界は66 kDa、SDS濃度が3.5 mMのとき分離様式が変化する境界は45 kDa、SDS濃度が7.0 mMのとき分離様式が変化する境界は14 kDaに変化することが明らかとなった。
超分子ヒドロゲルを支持体とした塩基性未変性タンパク質の電気泳動では、電気泳動に用いる緩衝液のpHを調整することで、電気泳動が効率的に進行することを見出した。超分子ヒドロゲルを支持体とした核酸類の電気泳動では、種々のサイズのDNA試料の電気泳動を検討し、20 k塩基対を超える大きな分子サイズのDNA試料の電気泳動が可能であることを明らかにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
超分子ヒドロゲルを支持体とした塩基性未変性タンパク質の電気泳動と、超分子ヒドロゲルを支持体とした核酸類の電気泳動の開発を中心に研究を進める。塩基性未変性タンパク質の電気泳動においては、種々の分子サイズ、等電点を有するタンパク質を用い電気泳動を検討し、超分子ヒドロゲルを支持体としたときの分離様式を明らかにする。核酸類の電気泳動においては、超分子ヒドロゲルを支持体としたとき、20 k塩基対を超える大きなサイズのDNAを電気泳動できることが明らかとなっている。現状のアガロースを支持体とした電気泳動では、こうした大きさの電気泳動は、通常のサブマリン型電気泳動装置による電気泳動では分離が困難で、パルスフィールド電気泳動法による分離を行う必要がある。そこで、超分子ヒドロゲルを支持体としたDNA電気泳動では、パルスフィールド電気泳動法に代わる、簡便な巨大DNA試料の電気泳動法となり得るかを検討する。具体的には、50 ｋ塩基対前後のDNA混合試料、150 ｋ塩基対前後のDNA混合試料を用いた電気泳動を検討し、その分離能を評価する。
また、電気泳動により適した支持体となる高強度超分子ヒドロゲルの開発にも着手する。本年度は、超分子ヒドロゲルへの化学架橋点の導入による超分子ヒドロゲルの高強度化を検討する。超分子ヒドロゲルは、ゲルを構築する過程の全てが可逆的な非共有結合を駆動力とするため、十分な強度を持たないことが多い。そこで、ゲルを構成する低分子ヒドロゲル化剤を適切なリンカーで結合させた二量体を合成し、これを低分子ヒドロゲル化剤と混合し、生成する超分子ヒドロゲルの化学架橋点として機能させる。
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