| 研究課題/領域番号 |
15H03826
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
山中 正道 静岡大学, 理学部, 准教授 (10377715)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ゲル / 自己集合 / 電気泳動 / 超分子 / タンパク質 / 核酸 |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質や核酸類などの生体高分子の分離分析手法として、ゲル電気泳動は広く利用される分析技術である。電気泳動における支持体であるゲルに着目したとき、ポリアクリルアミドまたはアガロースが用いられることが多く、それ以外の支持体を用いた電気泳動の報告例は皆無であった。我々は、生体高分子の電気泳動における新規な支持体として、超分子ヒドロゲルに着目した。低分子ヒドロゲル化剤の水中での自己集合により形成する、超分子ヒドロゲルは、分子設計に応じ様々に機能化することができる。そのため、超分子ヒドロゲルを支持体とした電気泳動法の確立は、生体高分子の分離分析手法の新機軸となり得る。我々はこれまでに、超分子ヒドロゲルを支持体とした、変性タンパク質および酸性未変性タンパク質の電気泳動法の開発を達成している。これらを基盤とし、本研究では、変性タンパク質の超分子ヒドロゲル電気泳動における界面活性剤の濃度効果、超分子ヒドロゲルを支持体とした塩基性未変性タンパク質の電気泳動法の開発、超分子ヒドロゲルを支持体とした核酸類の電気泳動法の開発を計画した。本年度は特に、大きなDNA断片の電気泳動を検討し、10万塩基対を超える大きなDNA断片であっても、通常のサブマリン型電気泳動装置を用いた電気泳動法にて分離可能であることを明らかにした。また、これらの検討と並行し、電気泳動の支持体としてより適切な素材開発を目的に、既存のポリアクリルアミドやアガロースと比較し、同等の強度を有する超分子ヒドロゲルの開発を行う。本年度は、超分子ヒドロゲルの化学架橋点として機能し、超分子ヒドロゲルの高強度化が期待できる低分子ヒドロゲル化剤を共有結合で連結した二量体を合成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成28年度は、超分子ヒドロゲルを支持体とした、大きなDNA断片の電気泳動を検討した。その結果として、10万塩基対を超える大きなDNA断片であっても、通常のサブマリン型電気泳動装置を用いた電気泳動法にて分離可能であることを明らかにした。まず、2.0、2.3、4.4、6.6、9.4、23.1千塩基対のDNA断片を含むマーカーの超分子ゲル電気泳動による分離を検討した。2.0 wt%の超分子ヒドロゲルを支持体とし、150 V-90分の条件にて電気泳動を行った。その結果、それぞれのDNA断片の十分な分離が達成できた。より大きなDNA断片を含むマーカー（10.1、15.0、17.1、24.0、24.5、30.0、33.5、38.4、48.5千塩基対）の分離を検討した。このマーカーは含まれるDNA断片の数が多いため、より薄い濃度の超分子ヒドロゲル（1.0 wt%）を支持体とすることが効果的であった。分離能はそれほど高くはないものの、一般的にはパルスフィールド電気泳動法を用いなければ分離が困難なサイズのDNA断片が、サブマリン型電気泳動装置を用いても分離できた。さらに大きなDNA断片を含むマーカー（10.1、17.7、21.1、23.5、41.8、50.3、165.7千塩基対）の分離を検討した。特筆すべき結果として、41.8、50.3、165.7千塩基対のDNA断片は、支持体である2.0 wt%の超分子ヒドロゲル中で異なる移動度を有していた。
電気泳動により適した支持体となる、高強度超分子ヒドロゲルの開発を検討した。超分子ヒドロゲルへの化学架橋点の導入により、超分子ヒドロゲルの高強度化が実現できる考え、低分子ヒドロゲル化剤を適切なリンカーで結合させた二量体を合成した。
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| 今後の研究の推進方策 |
超分子ヒドロゲルを支持体とした大きなDNA断片の電気泳動においては、超分子ヒドロゲルの濃度や、緩衝液の濃度、電気泳動における電圧などの条件をより詳細に検討し、明確な分離が達成できる条件を見出す。超分子ヒドロゲルを支持体とした、塩基性未変性タンパク質の電気泳動においては、これまでに約10種類の塩基性タンパク質の電気泳動を検討している。本年度は、これらタンパク質の分離様式を解析する。
化学架橋点を有する高強度超分子ヒドロゲルの開発においては、低分子ヒドロゲル化剤として機能する両親媒性トリスウレア分子を、共有結合により連結した二量体の合成を検討した。幾つかの合成経路の再構築を経て、目的とする二量体の合成が達成できた。本年度は、両親媒性トリスウレア分子と二量体の混合物を用い、超分子ヒドロゲルの構築を検討する。超分子ヒドロゲルを構成する集合体中にランダムに分散した二量体は、集合体間を共有結合で連結する化学架橋点として機能することが期待できる。その結果、形成する超分子ヒドロゲルの強度は向上する。二量体の添加により生じる超分子ヒドロゲルの物性の変化を、レオメーターを用いた動的粘弾性測定の結果を解析することにより評価する。さらには、化学架橋点により高強度化された超分子ヒドロゲルを用い、生体高分子の電気泳動を検討する。
また、短工程で合成可能な、新規低分子ヒドロゲル化剤として、疎水基としてアルキル基、親水基として乳糖を有する両親媒性ウレイド誘導体の開発に成功した。本年度は、この化合物のゲル化能を詳細に評価し、動的粘弾性測定の結果より電気泳動に適した物性を有した超分子ヒドロゲル化を評価する。もし、適した物性を示さなかった場合には、疎水基を種々変換した誘導体を合成し、電気泳動に適した超分子ヒドロゲルを形成する新規化合物を探索する。
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