| 研究課題/領域番号 |
15H03832
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| 研究機関 | 秋田大学 |
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研究代表者 |
尾高 雅文 秋田大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20224248)
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| 研究分担者 |
松村 洋寿 秋田大学, 工学(系)研究科(研究院), 講師 (60741824)
野口 恵一 東京農工大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (00251588)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 触媒反応機構 / 反応中間体 / 翻訳後修飾 / 時間分割結晶構造解析 / 質量分析 / FTIR |
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| 研究実績の概要 |
ニトリルヒドラターゼ(NHase)は、システインスルフェン酸(Cys-SO-)とシステインスルフィン酸(Cys-SO2-)を配位子とする特異な非ヘム鉄または非コリンコバルト活性中心をもつ。これまでに、研究代表者らは、Rhodococcus erythropolis N771由来鉄型NHase (ReNHase)のβR56K変異体を用いた時間分割結晶構造解析を行い、Cys-SO-配位子の側鎖スルフェニル基が非ヘム鉄に配位した基質のニトリル炭素を求核攻撃し、環状中間体を形成することを明らかとしている。また、18Oラベルした水で調製した野生型ReNHaseにメタクリロニトリルを基質として十分量加えて触媒反応をさせたときのFTIRスペクトルから、システインスルフェン酸基(Cys-SO-基)のスルフェニル酸素が溶媒分子と交換されることが示唆された。2015年度は、触媒反応中のスルフェニル酸素の交換を、18Oラベルした水で調製した野生型ReNHaseの質量分析で解析することを試みた。しかし、触媒反応が極めて早く、触媒反応が酵素液中の局所のみで起きている可能性を否定できず、更なる反応条件の検討が必要であった。一方、時間分割結晶構造解析に使用したβR56K変異体の構造データを用いて理論計算によって反応モデルを検証したところ、この変異体では、時間分割結晶構造解析で得られた環状中間体から先に触媒反応が進みにくいことが予測された。新たな時間分割構造解析用変異体として、種々のニトリルヒドラターゼ間で高度に保存されているβTyr37をフェニルアラニン、アラニン、ロイシンに置換した変異体を構築し、時間分割結晶構造解析のための結晶化を開始した。また、中性子構造解析に向けて、野生型ReNHaseの大量調製と大型結晶を得るための条件検討を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究代表者は、平成26年度10月に秋田大学に着任し、平成27年度4月より実験スペースを確保して研究を開始した。しかし、平成27年度前半は研究協力者の交替による実験技術の向上に時間を割く必要があり、後半になって、タンパク質精製装置や研究用保冷庫等の故障による実験の停止を余儀なくされたため、当初の予定よりも実験の進捗状況に遅れを生じることとなった。故障した装置は、研究費の前倒し申請を承認いただいたことで回避されており、当初の予定よりも若干遅れが出ているが、現在は順調に研究を推進できている。
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| 今後の研究の推進方策 |
18Oラベルした溶媒中での触媒反応の解析に関しては、基質の添加方法の最適化と触媒活性を低下させた変異体の利用などにより、質量分析による解析を実現する。また、新たに構築したβTyr37の変異体を用いた時間分割結晶構造解析を行い、新たな反応中間体の立体構造を得る。得られた結果を理論計算に適用し、反応モデルを検証する。また、1 mm×1 mm×2 mmサイズの結晶作成条件を検討し、中性子構造解析を試みる。
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