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ニトリルヒドラターゼ(NHase)は、Cys-SO-とCys-SO2-を配位子とする特異な非ヘム鉄または非コリンコバルト活性中心をもつ。アクリルアミド工業生産用触媒やシアン系廃液浄化への利用など産業に極めて重要な酵素であるが、触媒機構は未解明である。研究代表者らは、Rhodococcus erythropolis N771由来鉄型NHase (ReNHase)の低活性型変異体を用いた時間分割結晶構造解析を行い、Cys-SO-配位子の側鎖スルフェニル基が非ヘム鉄に配位した基質のニトリル炭素を求核攻撃し、環状中間体を形成することを明らかとした。しかし、理論計算からこの変異体では環状中間体以降の反応が進行しないことが示された。そこで、X線レーザーによるフェムト秒時間分割構造解析で野生型酵素の触媒過程を解析することを目的とし、顕微分光測定による中間体の捕捉と微結晶の作製を試みた。NO結合型ReNHase結晶の紫外可視顕微分光スペクトルを解析した結果、溶液と同様に、暗状態では380nm付近に吸収ピークを示したのに対し、光照射後に凍結した後は380nm付近の吸収ピークが減少し、700nm付近に吸収極大が観察された。次にNO結合型ReNHase結晶に、基質としてメタクリロニトリルをソーキングした後、光照射をして時間分割スペクトル変化を観察した結果、450~500nm付近で吸収ピークが見られた。すなわち、結晶中の反応中間体を顕微分光で捕捉できたものと考えられる。次に、NO結合型ReNHaseの微結晶の大量作成条件をバッチ法により確立した。
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