| 研究課題/領域番号 |
15H03931
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
巽 和也 京都大学, 工学研究科, 准教授 (90372854)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | マイクロ流路 / 血栓 / 熱物性 / 温度 / 物質拡散 / 凝固時間 / フィブリン塊 |
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| 研究実績の概要 |
平成２８年度は，血栓の熱物性を計測するために3種類の測定装置を立ち上げた．1つはマイクロ流路であり，2つ目はガラスマイクロキャピラリー，3つ目はキュベットである．マイクロ流路では壁面近傍における血小板の活性化とそこから成長するフィブリン網の温度依存性を高分解能で測定出来る．ガラスマイクロキャピラリーは圧力一定条件における流量の変化を測定することで血栓形成（凝固）に要する時間と温度の関係を簡便に測定出来る．キュベットは溶液を攪拌しながらその透過光強度とスペクトルを測定し血栓形成やフィブリン濃度を簡便に測定出来る．これらを用いて，静脈血栓の代表特性であるフィブリン網の形成における温度と流れの影響の測定および温度に基づく反応速度定数を見積もった．
その結果，マイクロ流路では温度により血小板の付着後のフィブリン網の形成時間および駆動圧力一定の場合の流量の低下に要する（凝固に要する）時間が変化した．この場合，温度が低下する程，凝固時間が減少することが分かった．実験の精度と信頼性を向上するためにキュベットを用いて凝固時間と温度の関係を求めた結果，37℃近傍を極小値として低温と高温側では凝固時間が低下した．マイクロキャピラリー装置でも同様の結果が得られたことから，流れの有無に依らない温度に依存した特性であることが分かった．37℃以上の場合はフィブリン反応の酵素であるトロンビンの熱変性によるものである．37℃以下の場合はフィブリノーゲン→フィブリンモノマー反応における反応速度定数の温度依存性であり，フィブリン濃度の時間変化を測定し反応定数と温度の関係を求めた結果，良好なアレニウスプロットが得られた．この結果から血栓形成（凝固）における温度依存性は静止流体だけでなく流れの中でも同様に影響し37℃にて最も血栓形成時間が短いことを示した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
２７年度予算の繰越を申請した時点では，マイクロ流路を用いた測定の結果，静脈血栓の形成には流れだけでなく，壁への血球細胞の接着やそれに伴う流れ場の変動，上流での血小板の活性化と血栓形成の状態，流れのせん断応力と対流輸送に影響されることが判明し，様々な要因によりフィブリン網の成長等の血栓形成の形態が変化することが分かった．このため，熱物性測定を行うためにはフィブリン生成反応と流れ場の影響をより明確に測定ができる装置が必要となり，繰越申請により２つの実験系を新たに製作した．
この時点で研究計画は一時的に遅延したが，温度の影響を他の要因から差別化できたこと，２７年度の経験を基に測定時間を短縮できる計測機構を開発したこと，から試料数と感度増大を実現し測定精度が大きく向上した．その結果，静止流体と流動条件下について，それぞれ血栓形成反応と温度との関係を高い再現性で測定することが出来た．また時間変化を測定することにより反応速度定数と温度の関係も求めることが出来た．
さらにマイクロ流路における血小板やフィブリン網の蛍光観察をより鮮明に行えたことから平成２７～２８年度の研究計画であった血栓反応に係る熱物性を測定する点について計画通りの成果が得られたと言える．これらの成果は国内外の学会で５本の論文で発表しており，論文も執筆している．
一方，血小板の１細胞分析や血小板からの物質拡散と温度との関係の測定については，一細胞分析用の装置が開発出来ていないこと，明確な物質濃度の分布が得られていないこと，の点から計画が十分に達成されていない．これらは血小板を１細胞のみ捕獲するのが困難であることや物質濃度分布が上流の血小板からの放出の影響を受けること，が原因である．この課題を解決するために，複数の血小板を１箇所に群集させ，周囲の影響を受けない環境で温度と物質拡散の影響について測定出来る装置の開発を行っている．
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| 今後の研究の推進方策 |
流れにおける凝固時間と温度の関係および反応速度が求まったが，一方で赤血球運動や壁面のコーティング，流路上流における血栓と他の血球細胞の壁面への接着等が血小板の活性化とフィブリン網の形状に影響することや，血小板の壁面への接着の瞬間を捉えることが困難である等のことから，血小板を一細胞単位で捕獲し，その周辺と下流におけるフィブリン網を計測できる装置の開発が必要である．これにより，フィブリン（繊維）の成長と温度との関係を正確に測定することが可能であり反応速度定数と反応領域を測定出来る．
さらに血小板から放出されるトロンビン等の活性化因子の分布と濃度の測定も重要である．流れは細胞やフィブリンへの力学的作用だけでなく濃度分布に影響を与える．濃度分布は反応という点に対しては温度（熱物性）と密に関係があることから，血小板の下流における活性化因子の濃度分布の可視化を蛍光標識により行う．この場合，物質の拡散係数が重要な要素であり，拡散係数は赤血球等の血球細胞の運動の影響を受けることから，血流中の特に壁面近傍の拡散係数を計測する．
これらの結果により一細胞単位の反応定数と温度特性を評価し，拡散係数と合わせて数値シミュレーションに必要な物理量と諸変数を提供することを図る．
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