| 研究課題/領域番号 |
15H04189
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
梅野 太輔 千葉大学, 大学院工学研究科, 准教授 (00400812)
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| 研究分担者 |
河合 繁子 千葉大学, 大学院工学研究科, 助教 (40638920)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | スクアレン / ホペン / スクアラン / トリテルペン / 進化分子工学 / ライブラリ / スクリーニング / セレクション |
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| 研究実績の概要 |
我々は，いままで長らく不可視であった細胞内のスクアレン合成酵素の活性を色スクリーニングする手法を開発した．スクアレンの蓄積過程を可視化できるということは，スクアレン合成酵素という創薬ターゲットの阻害剤探索などに利用できるのみならず，蓄積したスクアレンの消費活性を可視化できる可能性も示している。
本研究では，スクアレン合成酵素を転化してさまざまな有価物質を合成する酵素活性を標的とした，(1)ホペンサイクラーゼの細胞機能の改良、(2)オキシドスクアレン合成経路の再構築，(3)スクアレン水素化機能の探索と改良，などを試みることを目的としている。また，これらの酵素の基質特異性を拡張し，(4)非天然サイズのスクアレンを出発物質とする新規な骨格構造の組織的な創出も目的とする。
[項目1] その初年度にあたって我々は，ブドウ球菌由来のCrtNという酵素とさまざまな種に由来するスクアレン合成酵素を大腸菌に共発現する系を作製した。再現性よくスクアレン蓄積量を可視化できる系が完成した。
[項目2] スクアレン合成酵素のサイズ変異体を取得し，C20を基質とするC40型のスクアレン合成経路の確立にも成功しその消費活性スクリーニング系も確立できた。
[項目3] ホペンサイクラーゼをスクアレン合成酵素と共発現した。野生型のホペンは大腸菌内の活性が非常に弱く，スクアレンのごく僅かをホペンに転化するのみであり，大量のスクアレンが未転化のまま残されてしまった。スクリーニング系（項目1）も完成し，伸び白の高い標的も定まった。来年の進化工学が愉しみな状況である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
[項目1] ブドウ球菌由来のCrtNという酵素とさまざまな種に由来するスクアレン合成酵素を大腸菌に共発現する系を作製した。CrtNはデヒドロスクアレンを効率よくカロテノイド色素し，大腸菌のコロニーの色を強い黄色にする。しかしスクアレンの転化速度は遅く，わずかに色づく程度である。CrtNのライブラリの中から，より効率的にスクアレンを色素化できる変異体の取得を目指したが，不成功に終わった。そこでコンストラクトの発現条件および培養条件をスクリーニングし，再現性よくスクアレン蓄積量を可視化できる系が完成した。この項目は完了したものと判断する。
[項目2] スクアレン合成酵素のサイズ変異体を取得し，C20を基質とするC40型のスクアレン合成経路の確立にも成功しその消費活性スクリーニング系も確立できた。のこる目標は，実際にこの新規活性を探索するだけである。これは来年度以降に実施する予定であったため，順調といってよい。
[項目3] ホペンサイクラーゼをスクアレン合成酵素と共発現した。野生型のホペンは大腸菌内の活性が非常に弱く，スクアレンのごく僅かをホペンに転化するのみであり，これもまた予定通りである。
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| 今後の研究の推進方策 |
現状，申請書のとおりに研究は進展しており，とくに大きな変更なく研究を推進してゆきたい。平成２９年度は，とくに以下３点に注力してゆきたい：
[項目3-1] ホペンサイクラーゼの活性向上した変異体を得る
[項目3-2] オキシドスクアレンの合成活性が，ついに大腸菌内で働くようになった。この細胞活性を高める進化工学を行う。
[項目4] スクアレンの水素添加機能をもつ遺伝子の探索を行う。
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