| 研究課題/領域番号 |
15H04195
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
山地 秀樹 神戸大学, 工学研究科, 教授 (40283874)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 昆虫細胞 / 組換えタンパク質生産 / ウイルス様粒子 |
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| 研究実績の概要 |
ウイルス様粒子は，ウイルス感染症を予防するための有効かつ安全な次世代ワクチンとして利用が期待されている．本研究の目的は，インフルエンザウイルス様粒子ワクチンを迅速に高生産するための新たな技術基盤を確立することである．このため本研究では，A型のインフルエンザウイルスの構造タンパク質であるヘマグルチニンHAおよびマトリックスタンパク質M1の遺伝子を共発現する組換え昆虫細胞を作製し，両タンパク質と脂質二重層から構成されるインフルエンザウイルス様粒子の連続分泌生産系を構築する．
これまでに，インフルエンザAウイルスのHAおよびM1の遺伝子を，異なる薬剤耐性遺伝子を有する2種類の高発現型プラスミドベクターにそれぞれクローニングした．これらのプラスミドを昆虫細胞にコトランスフェクションし，薬剤耐性遺伝子に対応する2種類の抗生物質の存在下で培養することにより，HAおよびM1の両遺伝子が染色体に組み込まれた安定形質転換細胞を取得している．この際，Drosophila由来のBiPシグナル配列をHA，M1両遺伝子の上流に付加したところ，付加していない場合に比べて，HAおよびM1の分泌生産量が著しく増大することを見出した．また，ニワトリ赤血球を用いた赤血球凝集試験により，培養上清中のHAが赤血球凝集活性を有することを確認した．さらに，培養上清をポリエチレングリコール沈殿法およびショ糖密度勾配遠心分離法で処理することによりインフルエンザウイルス様粒子を精製し，これを抗原としてウサギに免疫することにより抗血清を作製した．今後，この抗血清を用いた酵素免疫測定法 (ELISA) を確立し，HAを定量することにより，組換え昆虫細胞によるインフルエンザウイルス様粒子の生産特性を明らかにする．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Drosophila由来のBiPシグナル配列をHAおよびM1両遺伝子の上流に付加することにより，組換え昆虫細胞によるインフルエンザウイルス様粒子の分泌生産量を著しく増大することに成功した．また，赤血球凝集試験により，分泌されたHAが赤血球凝集活性を有することを確認できた．
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| 今後の研究の推進方策 |
作製した組換え昆虫細胞を用いて振とう培養等を実施し，酵素免疫測定法 (ELISA) や赤血球凝集試験によってHAの濃度および活性の経時変化を評価することにより，組換え昆虫細胞の増殖特性およびインフルエンザウイルス様粒子の生産特性を解明する．また，組換え昆虫細胞の培養上清をポリエチレングリコール沈殿法やショ糖密度勾配遠心分離法で処理し，これらの分離精製操作がウイルス様粒子に及ぼす影響を明らかにする．
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