| 研究課題/領域番号 |
15H04282
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
金井 正美 東京医科歯科大学, 実験動物センタ－, 教授 (70321883)
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| 研究分担者 |
平手 良和 東京医科歯科大学, 実験動物センタ－, 講師 (70342839)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 着床不全 / マウス / 不妊 |
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| 研究実績の概要 |
既婚カップルの10-25％が不妊に悩み、その40%は母体が要因であると考えられている。受精胚研究と比較すると、着床については、母体要因について系統だった基礎的研究が殆どなされていないのが現状である。我々は、Sox17（Sry-related HMG box）ノックアウト／Sox17-GFPノックイン／Sox17点変異SHIVAマウスの３種類のmutantマウスを用いて、IVF卵をヘテロ母もしくはワイルド母へ移植した場合、母体がヘテロ個体でのみの任性が著しく低くなることを発見した。そこでまずは、野生型マウスの卵巣、子宮を用いて、内在性のSOX17と他のSoxFグループ（Sox7, Sox18)の発現部位の同定を行った。その結果、卵管上皮、子宮内膜上皮、子宮腺でSOX17の強い発現を認めた。着床時（妊娠４日）の受精卵と子宮内膜に関してSox7, Sox18と比較したところ、Sox17とSox7の発現が観察されたが、卵管上皮ではSox17とSox7は同様の発現レベルであったにも関わらず、Sox17は子宮内膜上皮で非常に強い染色を示した。IVF受精卵を野生個体並びにヘテロ個体へ移植したところ、任性の低下が観察されたので、人工的要因を除くため、自然交配のデータ再構築を実施した。その結果、平均値8.3vs1.5と著しい着床率の低下が観察された。同様に、SHIVAマウス（point mutant)を用いて検討した結果、着床率は3.7個と比較的マイルドな表現系を呈した。受精胚の発生プロセスは野生型、ヘテロ個体ともに正常発生を呈した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
着床不全の原因は母体であることを証明するために、胚発生過程を(1)排卵(2)受精(3)胚発生(4)着床の４ステップで実施した。更に、PMSG/hSG処理後に採卵したSox17ヘテロ(Sox17 +/-)とwild type胚の発生プロセスをin vitroの各ステージで確認し、Sox17 +/- とwild type胚をそれぞれwild typ母体、Sox17 +/-母体へ移植することで着床率の確認を行った。blue dye(Chen Q et al., Mol Asp Med 2013)により着床部位をマークし、子宮全体を可視化することに成功した。精管結紮♂と各♀マウス(Sox17 +/- とwild type)をmatingし、その後、各Sox17 +/- とwild type胚移植を実施し、妊娠５日齢にて子宮全体を採取し、着床率確認出来た。また関連Sox遺伝子の発現を組織化学的に検討した。その際にSox17-GFP♀とRosa-H2B-mCherry♂（核赤蛍光）の掛け合わせを実施し蛍光実体顕微鏡下でEx vivoで可視化をトライしたが、in vitro実験系の開発のためには、更なる検討が必要と思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
SoxF subgroup(Sox17,7,18)の内在性発現について、子宮内膜上皮、子宮腺、卵巣と詳細の発現について、RT-PCRによるRNA、並びに、western blottigによるタンパク発現量について、詳細な定量解析を実施することで、遺伝子相補の可能性などを検討する。更に、着床前後の子宮内膜から内膜上皮のみ単離することで、純粋なRNAを単離し、DNA arrayにより遺伝子プロファイリングを実施し、着床時イベントに重要な因子の同定を試みる。具体的にはSox17 +/-とwild typeの子宮内膜上皮(SOX17の発現が維持されている)領域からtotal RNAをそれぞれ精製し、増幅、合成を行いbiotin標識したcRNAプローブを作製し、各々のサンプルをハイブリダイズさせる。その後、専用のアレイスキャナでシグナルを検出し、wild typeと比べてシグナル比が有意に偏っている遺伝子群を同定する。その中で発現量に2倍以上の変化が認められた遺伝子(Sox17下流遺伝子候補)に対し、qPCR法により、Sox17 +/- とwild type間での発現量の差異を定量化する。また、有意に発現量の変化が認められた遺伝子に対し、妊娠後に経時的にサンプリングした横断切片を用いたin situ hybridizationを行い、Sox17とoverlapかつ類似した発現パターンを示す遺伝子群を標的遺伝子候補として最終的に選別する予定である。
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