研究課題
マウス遺伝学では、これまで、相同組換えによる遺伝子ノックアウト、Cre/loxPによる部位特異的組換え、トランスポゾンによる遺伝子導入などの「ゲノム工学」が着実に発展してきた。また近年は、CRISPR/Casなどの部位特異的ヌクレアーゼを用いた「ゲノム編集」が可能となっている。本研究では、この「ゲノム工学」と「ゲノム編集」を組み合わせ、比較的広いゲノム領域の機能解析を効率的に行うためのゲノム改変技術の開発を試みた。まず、培養マウスES細胞の系で、トランスポゾンとloxP配列を含むDNAカセットを特定のゲノム領域に相同組換えで挿入させた後、近傍のゲノム領域に転移させ、カセットの再挿入部位を同定した。次に、トランスポゾンの起点と終点の間でCre/loxP部位特異的組換えを誘導し、広い範囲のゲノム再構成変異（欠失・逆位・転座）導入を試みた。その結果、組換え効率はloxP間の距離が増大するにつれて低下した。そこで、Cre/loxPと同時に、CRISPR/Casを適切な部位に作用させることで標的ゲノム領域の空間配置に変動を加え、それによる長距離部位間の組換え効率への影響を解析した。また、変異誘導における相同染色体の干渉を排除する目的で、半数体マウスES細胞の利用を検討した。その結果、大規模ゲノム再構成変異の導入が一定の効率、かつある程度制御された形で可能であることが示された。しかしながら、「部位特異的組換え」と「部位特異的ヌクレアーゼ」の同時適用がもたらすゲノム挙動は当初の予想を越えて複雑であり、これまでのところ、それぞれを単独で利用した場合の効率と比較して有意な効率上昇が得られる条件を確立するまでには至っていない。今後の課題として、トランスポゾンによるloxP導入部位とCRISPR標的配列の位置の組み合わせをさらに変化させ、最適条件を見出す検討が必要である。
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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Nucleic Acids Res.
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10.1093/nar/gky183
