研究課題
Cushing病は、脳下垂体のACTH産生細胞の腫瘍からACTHが過剰分泌されることで、肥満、糖尿病、高血圧、筋力低下など様々な症状をきたす内分泌性疾患である。しかしCushing病の病態にはまだよくわかっていない部分が多く、その理由の１つとして、これまでCushing病の優れた動物モデルが存在しなかったことが挙げられる。そこで本研究ではCushing病の動物モデルの確立をめざし、脳下垂体のACTH産生細胞に特異的にヒトCushing病腫瘍に見られる変異USP8を発現するトランスジェニック・マウスの作出を試みている。脳下垂体のACTH産生細胞に特異的に発現するプロオピオメラノコルチン遺伝子のプロモーターの下流に変異USP8をつないだDNAをもつトランスジェニック・マウスを作出し、脳下垂体において変異USP8タンパク質を発現する系統を得た。その系統のマウスの飼育を継続しているが（最高齢で～12ヶ月齢）、今のところまだCushing病に見られる症状は観察されていない。そこで、この系統のマウスの飼育を継続して表現型の解析を続けるとともに、このシステムでは変異USP8の発現が弱くCushing病症状に至らない可能性を考え、より強い普遍的プロモーターの下流で変異USP8を発現させるトランスジェニック・マウスの作出にも着手している。その一方で、USP8変異をもつCushing病のモデル細胞を作出するため、CRISPR-Cas9システムを用いてヒトCushing病におけるUSP8変異を模倣するような欠失変異をもつマウスACTH産生細胞株AtT-20の樹立も推進している。
2: おおむね順調に進展している
ヒトCushing病腫瘍に見られる変異USP8を発現するトランスジェニック・マウスの作出に関しては、最初に試みた方法では脳下垂体ライセートを用いたイムノブロッティングで変異USP8の発現を検出することはできたものの、そのようなマウスにおいて現在までヒトCushing病に見られるような症状は観察されていない。しかし、脳下垂体特異的に遺伝子発現を誘導する既知のエンハンサーの種類は限定されており、変異USP8の発現量がCushing病をひき起こすに十分なレベルに到達していない可能性は当初から想定されていた。そのために、現在すでにより強力な普遍的CAGエンハンサーとCre-loxPシステムを用いたトランスジェニック・マウスの作出に着手しており、その進捗はおおむね順調ではないかと判断している。また新たに、CRISPR-Cas9法を用いてACTHを産生・分泌するマウス脳下垂体細胞株AtT-20にヒトCushing病腫瘍に見られるUSP8変異を導入した変異細胞株の作出を試みており、現在、期待する変異をもつAtT-20細胞株のクローニングを行っている段階である。これまで遺伝子導入効率が非常に低いという理由からAtT-20細胞における変異USP8の解析が困難であったため、この細胞株が樹立されれば、USP8変異によるCushing病の優れたモデル細胞になると期待され、こちらも順調に進展している。
Cushing病患者で見出された変異USP8をコンディショナルに発現するトランスジェニック・マウスを作出し、これまで存在しなかったCushing病の動物モデルを樹立する。まず、普遍的CAGプロモーターと変異USP8 cDNAの間にlox P配列ではさんだスタッファー配列を挿入したコンストラクトをもつトランスジェニック・マウスを作出する。このマウスをPOMC-Creマウス(Jackson Laboratoryより入手可能)と交配して脳下垂体特異的にCreリコンビナーゼを発現させ、脳下垂体のACTH産生細胞だけでスタッファー配列を除去して変異USP8を発現誘導するシステムを構築する。そして、このトランスジェニック・マウスの脳下垂体における変異USP8タンパク質の発現と腫瘍形成、そして血中のACTHやコルチゾールの濃度上昇、肥満、糖尿病などのCushing病症状を解析する。USP8変異によるCushing病発症の分子機構の詳細を解明するためには、USP8変異体を発現するACTH産生細胞株を用いた解析が不可欠である。そこで、CRISPR-Cas9システムを用い、Cushing病におけるUSP8の活性化変異を模倣すると期待される14-3-3タンパク質結合モチーフの欠失変異を有するAtT-20細胞株を樹立する。そしてその細胞においてCushing病における変異USP8の性状（14-3-3タンパク質結合性、分子内切断、酵素活性の上昇、核局在など）が再現されているか検討し、確認された場合にはこのAtT-20細胞株を用いて細胞膜タンパク質や核タンパク質のユビキチン化や発現のレベル、およびACTH前駆体タンパク質POMCの遺伝子発現レベルを正常AtT-20細胞と比較することで、USP8変異によるCushing病発症の分子機構に迫る。
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