動物RNAウイルス生活環の試験管内再現

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H04324
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 今高 寛晃 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (50201942)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 試験管内タンパク質合成 / 翻訳 / ＲＮＡウイルス / ウイルスプロテアーゼ / 新生鎖 / リボソーム

研究実績の概要

まず、EMCVウイルスの3Cプロテアーゼがリボソームのどこに結合するのかを決定した。3CプロテアーゼのN末がリボソームとの結合に必要であることが分かっていたので、N-末付近にアンバーコドンを導入した。再構成翻訳システムにて、このコンストラクト（3C-amber-His）を翻訳する際、翻訳停止因子（eRF）を除きpBP-サプレッサーtRNAを加えた。このことにより3CのN末にpBPを導入した。翻訳後、UV照射を行うことによりpBPを活性化し、3Cを付近のRNAやタンパク質と架橋させた。尿素で変性後、ニッケルカラムで3C-架橋物を精製した。この精製産物をゲルで分離後ニトロセルロース膜に転写し、RNase処理により結合に関与していないRNAを分解した。残ったRNAの3’にポリAを付加し、逆転写酵素によりcDNAに変換した。このcDNAをクローニングし配列を決定した。配列解析によると結合RNAは60Sリボソームサブユニットのexpansion segmentの配列を持っていた。expansion segmentは真核細胞のリボソームに特有のRNA配列で、リボソームのコア構造から触覚のように外に飛び出しているRNAである。恐らく、３CはこのRNAに結合して、ウイルス新生鎖を効率よく切断しているものと推測される。
次に、他のウイルスが持つプロテアーゼも同様にリボソーム結合能があるかどうか調べた。すると、近縁ウイルスであるA型肝炎ウイルス、ライノウイルス、そして近縁ではないC肝炎ウイルスのプロテアーゼもリボソーム結合能を持つことがわかった。更に、上記の方法で、C肝炎ウイルスプロテアーゼがリボソームのどこに結合するのかを調べると、やはり、60Sリボソームサブユニットのexpansion segmentであった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

人工細胞とウイルス合成の技術基盤は構築でき、業績も上がってきている。また、更に対象ウイルスを広げることができ、研究は順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

３０年度までに、脳心筋炎ウイルス（EMCV）とC型肝炎ウイルス（HCV）の試験管内合成を進めてきた。更に研究対象として日本脳炎ウイルス（JEV）を加える。以下のようにEMCV,HCV, JEV　RNAの試験管内複製実験を進める：（１）HCVとJEVのRNAレプリコンコンストラクトを完成させる。（２）HeLa細胞抽出液由来試験管内タンパク質合成系を用いた複製実験（３）ヒト因子由来完全再構成型翻訳システムを用いた複製実験

研究成果

• [国際共同研究] McGill university(カナダ)
  • 国名: カナダ
  • 外国機関名: McGill university
• [雑誌論文] The translation inhibitor Rocaglamide targets a biomolecular cavity between eIF4A and polypurine RNA. (2019)
  • 著者名/発表者名: Shintaro Iwasaki, Wakana Iwasaki, Mari Takahashi, Ayako Sakamoto, Chiduru Watanabe, Yiichi Shichino, Stephen N. Floor, Koichi Fujiwara, Mari Mito, Kosuke Dodo, Mikiko Sodeoka, Hiroaki Imataka, Teruki Honma, Kaori Furuzawa, Takuhiro Ito and Nicholas T. Ingolia
  • 雑誌名: Mol.Cell 巻: 73 ページ: 738-748
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2018.11.026
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Dom34 mediates targeting of exogenous RNA in the antiviral OAS/RNase L pathway (2019)
  • 著者名/発表者名: Nogimori, Takuto; Nishiura, Kyutatsu; Kawashima, Sho; Nagai, Takahiro; Oishi, Yuka; Hosoda, Nao; Imataka, Hiroaki; Kitamura, Yoshiaki; Kitade, Yukio; Hoshino, Shin-ichi
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res. 巻: 47 ページ: 432-449
  • DOI: 10.1093/nar/gky1087
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dynamic inteaction of poly(A)-binding protein with the ribosome (2018)
  • 著者名/発表者名: Kodai Machida, Tomoaki Shigeta, Yuki Yamamoto, Takuhiro Ito, Yuri Svitkin, Nahum Sonenberg and Hiroaki Imataka
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 8 ページ: 17435
  • DOI: 10.1038/s41598-018-35753-1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Palm-sized Ag ion emission gun operated at roomtemperature in non-vacuum atmosphere (2018)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Daiko, Kyohei Segawa, Kodai Machida, Hiroaki Imataka, Sawao Honda, and Yuji Iwamoto
  • 雑誌名: Adv. Engneering Mater. 巻: 20 ページ: 1800198
  • DOI: 10.1002/adem.201800198
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] In vitro analysis of actin fibrillization associated with developmental disorders (2018)
  • 著者名/発表者名: Kodai Machida, Kuru Kanzawa, Taiki Hakushi, Hiroaki Imataka
  • 学会等名: International symposium on proteins; from the cradle to the grave
  • 国際学会
• [学会発表] A viral protease efficiently processes the nascent viral polyprotein by interacting with the 60S ribosomal subunit (2018)
  • 著者名/発表者名: Yuki Yamamoto, Soshi Okadome, Takuhiro Ito, Kodai Machida, and Hiroaki Imataka
  • 学会等名: International symposium on proteins; from the cradle to the grave
  • 国際学会
• [学会発表] Elucidation of molecular mechanisms of PDI family enzymes acting on nascent chains in early-stage of translation (2018)
  • 著者名/発表者名: Chihiro Hirayama, Masaki Okumura, Kodai Machida, Kentaro Noi, Teru Ogura, Hiroaki Imataka and Kenji Inaba
  • 学会等名: International symposium on proteins; from the cradle to the grave
  • 国際学会
• [学会発表] HCV IRES CAPTURES A TRANSLATING 80S RIBOSOME TO HIJACK HOST TRANSLATIONAL MACHINERY (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Yokoyama, Kodai Machida, Tomoaki Shigeta, Madoka Nishimoto, Mari Takahashi, Wakana Iwasaki, Ayako Sakamoto, Mayumi Yonemochi, Hideki Shigematsu, Mikako Shirouzu, Hiroaki Imataka, Takuhiro Ito
  • 学会等名: Cold Spring Harbor Meeting Translational Control
  • 国際学会
• [学会発表] Interplay between PDI family enzymes and nascent chains for the catalysis of their oxidative folding (2018)
  • 著者名/発表者名: Chihiro Hirayama, Masaki Okumura, Kodai Machida, Kentaro Noi, Teru Ogura, Hiroaki Imataka, Kenji Inaba
  • 学会等名: 第19回蛋白質科学会
• [学会発表] 脳心筋炎ウイルス3Cプロテアーゼはリボソームに結合し効率的にウイルス新生鎖を切断する (2018)
  • 著者名/発表者名: 山本 悠貴、岡留 壮志、伊藤 拓宏、町田 幸大、今高 寛晃
  • 学会等名: 第20回日本RNA学会
• [学会発表] 脳心筋炎ウイルス3Cプロテアーゼはリボソームに結合し効率的に ウイルス新生鎖を切断する (2018)
  • 著者名/発表者名: 山本 悠貴、岡留 壮志、伊藤 拓宏、町田 幸大、今高 寛晃
  • 学会等名: 第5回 Ribosome Meeting
• [学会発表] アクチン遺伝病の試験管内解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 町田幸大、神澤空流、白子太紀、今高寛晃
  • 学会等名: 第９１回日本生化学会
• [学会発表] アクチン遺伝病の試験管内解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 町田幸大、神澤空流、白子太紀、今高寛晃
  • 学会等名: 細胞を創る研究会 １１.０
• [学会発表] アクチン遺伝病の試験管内解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 町田幸大、神澤空流、白子太紀、今高寛晃
  • 学会等名: 第１３回無細胞生命科学研究会
• [学会発表] ポリアミンによる翻訳フレームの+1方向へのシフト作用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 小黒明広，町田幸大，今高寛晃，松藤千弥
  • 学会等名: 第４１回 日本分子生物学会年会
• [学会発表] 新生鎖の構造形成を補助するPDIファミリー酵素の作用機序に関する研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 平山千尋、奥村正樹、町田幸大、野井健太郎、小椋光、今高寛晃、稲葉謙次
  • 学会等名: 第４１回 日本分子生物学会年会
• [学会発表] アクチン遺伝病の試験管内解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 町田幸大、神澤空流、白子太紀、今高寛晃
  • 学会等名: 第４１回 日本分子生物学会年会
• [学会発表] アクチン生合成の試験管内再現 (2018)
  • 著者名/発表者名: 町田幸大、神澤空流、井寄真仁、白子太紀、今高寛晃
  • 学会等名: 第4回デザイン生命工学研究会
• [備考]
  • URL: http://www.eng.u-hyogo.ac.jp/group/group37/