| 研究課題/領域番号 |
15H04337
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
廣明 秀一 名古屋大学, 創薬科学研究科, 教授 (10336589)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | タイトジャンクション / PDZドメイン / タンパク質間相互作用阻害剤 / 中分子創薬 |
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| 研究実績の概要 |
本申請研究は、タイトジャンクション動的平衡仮説にもとづき、TJの裏打ちタンパク質PDZドメインを標的とした創薬研究である。申請者は、更に他の経路のPDZドメインタンパク質に作用し、上皮細胞の形態を大きく変える化合物も同定した。それらの作用機序を分子的に解明することで、TJ制御薬や、制がん剤となるWntシグナル阻害剤などの薬効を更に増し、副作用を未然に回避するための技術基盤が構築できると考える。そこで、TJ制御ならびにアクチン細胞骨格制御、Wntシグナル伝達系などで働く制御蛋白質に含まれる9種のPDZドメインに対して、[化合物] ：[9種のPDZドメインとの物理化学的相互作用] ： [培養細胞レベルでのフェノタイプ]の複合的・統合的な構造活性相関の研究を行うこととした。平成28年度は、以下の研究を行った。
１．未整備のPDZドメインのタンパク質発現系（LARG, LIM-K1, LIM-K2）について、発現系を構築した。また既に構築していたDVL1-PDZ、DVL2-PDZについて発現系を最適化した。
２．LIM-K1-PDZドメイン単体でのNMRシグナル帰属を試みたが試料の性質が悪く断念した。
３．Afadin, DVL1, DVL2のPDZドメインに対するドッキング（バーチャルスクリーニング）を行った。DVL1-PDZについてはNMR解析も進めた。
４．既に所有している19種の化合物の細胞接着・バリア機能に関する細胞アッセイを進めた。二種類のサブタイプのMDCK細胞の他にCaco2細胞、Eph4細胞における経皮内電気抵抗（TEER）測定を行い、薬物の応答を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
１．平成２７年度は、特にLIM-K1およびLIM-K2のPDZドメインに注力して、そのNMR解析を完了し、立体構造解析まで進める予定であった。しかし、特にLIM-K1-PDZドメインのタンパク質としての性質が悪く、大腸菌での十分な発現量、ならびに、濃縮した際の単分散のタンパク質試料の特徴である、アミドシグナルの分離のよいNMRスペクトルが得られなかった。その対策として、構築した発現系のタンパク質の領域を精査し、発現系の作り直しを行った。同様の作業をDVL1-PDZに対しても行った。その結果、ヒトLIM-K2-PDZドメインについては、一定の改善を見たので、マウスLIM-K2-PDZドメインの既報の結果を参考にしつつ研究を進めることとした。結果的にLIM-K1-PDZの解析については断念せざるを得なかった。
２．Afadin, DVL1, DVL2のPDZドメインに対するドッキング（バーチャルスクリーニング）を行った。DVL1のPDZドメインについては、既に保有していた試料に比べて著しい性質の改善が見られ、NMRスペクトルの感度も向上した。そこで、DVL1-PDZについては3次元NMRの測定を進め、シグナル帰属の解析も進めた。
３．既に所有している19種の化合物の細胞接着・バリア機能に関する細胞アッセイを進めた。二種類のサブタイプのMDCK細胞の他にCaco2細胞、Eph4細胞、における経皮内電気抵抗（TEER）測定を行った。Caco2細胞は、既報の通り、ディッシュ上で安定した単層細胞シートを形成し、TJが形成し成熟するまで10日以上の日数がかかることがわかった。CLD2以外のCLDやOCLNについて、それぞれの細胞でのTJへの集積の様子を蛍光顕微鏡観察によって追跡し、TJ制御薬剤による変動の観察にも成功した。
これらを総合し、特に１の計画の一部の断念を重く見て、遅れているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記項目１の遅れを取り戻すべく、LIM-K2-PDZのNMR解析を進める。また、改質したDVL1-PDZのスペクトルの質がかなりよいので、DVL1-PDZのNMR解析ならびにDVLを標的としたインシリコスクリーニングを精力的に行う。バーチャルスクリーニングに関しては、複数のドッキングアルゴリズムを比較する以前に、研究代表者がこれまで使い込んできたGOLDの、複数（最大で16種類）のスコアリング関数について、実験データによるフィードバックをかけながら、最適化し、その最適化の結果をもって、新たに新規化合物をスクリーニングするというアイデアの着想に到った。そこで、NMR滴定実験の結果と、複数のバーチャルスクリーニングの結果の整合性を評価するための統計的手法など、来年度は、NMR実験とインシリコによる研究を同時に実施できる、当研究室の強みを活かした研究を推進することとする。
併せて、TJ動的平衡の細胞生物学的全体像を解明する基礎データとして、MDCK細胞、Caco2細胞、Eph4細胞のTJ形成過程の観察（とTJ制御剤を添加したときの変化の観察）を続ける。
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