| 研究課題/領域番号 |
15H04340
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
高橋 栄夫 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (60265717)
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| 研究分担者 |
竹内 恒 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 創薬分子プロファイリング研究センター, 主任研究員 (20581284)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | NMR / 膜タンパク質 / 酵母 |
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| 研究実績の概要 |
GPCRなどのヒト膜タンパク質発現において実績のある発現系である、メタノール資化性酵母P.pastorisを用いた、高分子量タンパク質に適応する同位体ラベル技術、特に重水素ラベルとメチル選択的C13ラベル技術の開発を進めた。これまでに酵母K.lactis発現系で行ったラベル法を適用したところ、Leu、Val残基のメチル基のラベル効率は極めて低く、ほとんど当該アミノ酸由来メチル基のNMRシグナルが観測できなかった。文献調査等より、アミノ酸Leu、Valの前駆体であるα-ケトイソ吉草酸から当該アミノ酸への変換がP.pastorisの細胞質において起こると推定されたことから、培地中のアミノ酸前駆体の細胞への取り込み率に問題があると考えられた。そこで、様々な培養条件（前駆体添加量・添加方法、培養温度、pH、等）を検討した結果、Leu、Val残基由来メチル基のNMRシグナルを十分な強度で観測することが可能となった。今後定量的な解析を行うとともに、ヒト膜タンパク質への適用を進める。また、膜タンパク質およびその複合体の主鎖構造情報を取得するアプローチとして、N15観測TROSY法を着想した（Takeuchi et al, JBNMR (2015)）。本手法は原理的に重水素化を必要とせず、また高塩濃度での測定も可能であることから、膜タンパク質を含め、高い汎用性が期待できる。
また、脂質二重膜環境におけるヒト膜タンパク質解析のための試料調製技術については、ナノディスクを活用した手法がほぼ確立できた。ただし、膜タンパク質を組み込んだナノディスクの収量については、扱う膜タンパク質の種類により大きく異なるため、今後さらなる条件検討を進めていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
高分子量タンパク質のNMR構造解析において汎用的に用いられるメチル基選択的C13ラベル法を酵母P.pastorisに適応させるアプローチについては、当初想定していなかった問題が明らかとなったが、培養条件を詳細にチェックすることで、NMR解析が可能なレベルでのラベル試料調製が可能となってきた。また、膜タンパク質を含む高分子量タンパク質の主鎖構造情報を取得するうえで有効と考えられるN15観測TROSYアプローチを開発したため、今後、その有効性を確認していく。
ナノディスクを活用した膜タンパク質試料調製技術についてもほぼ順調な進捗であるといえる。複数のヒト膜タンパク質の酵母細胞による発現も行っているが、対象により、発現量や可溶化法に関する問題もあるため、今後その対策を進める必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
酵母細胞を活用したラベル法については、その効率を定量的に捉える試みを進めるとともに、さらなるラベル率向上のための検討も行う。また、NMR構造解析対象となるヒト膜タンパク質発現については、さらにGPCRなどの複数の新規な対象も取り入れた検討を行うとともに、脂質二重膜環境（ナノディスク）と界面活性剤環境における、膜タンパク質挙動の相違などに着目した解析を進める。
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