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2018 年度 実績報告書

PINK1/リン酸化ユビキチンによるユビキチン転移酵素Parkinの活性化機構

研究課題

研究課題/領域番号 15H04342
研究機関京都大学

研究代表者

菅瀬 謙治  京都大学, 工学研究科, 准教授 (00300822)

研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2019-03-31
キーワードタンパク質 / 分子認識 / NMR
研究実績の概要

NMR測定用の13C,15N標識rat parkinとhuman parkinの大量発現を試みている。LB培地では可溶性画分に発現されるのだが、安定同位体標識試料用のM9培地では常に不溶性画分に発現されて問題となっていた。様々な発現タグも試したが可用性画分に目的タンパク質を得ることができなかった。そのため、不溶性画分からの抽出およびリフォールディングを試したところ、活性をもったparkinが少量ではあるが得られることが分かった。そこで、まずは収量を上げるために、様々、条件検討を行った。その結果、まず、human parkinのUBLドメインを欠損させたRORBR領域(ドミナントアクティブ体)にHis6-SUMOタグを付加したものが最もよいコンストラクトであった。このコンストラクトの発現ベクターを用いて、37℃でタンパク質発現させると最も収量が高かった。リフォールディングについては、4M尿素でタンパク質を可溶化し、アルギニンやZnCl2(parkinはZnフィンガードメインを持つ)を加えたバッファーから透析で尿素を段階的に除去した。得られたparkinには自己ユビキチン化活性を持ち、さらにそのNMRスペクトルを測定することができた。ただし、リフォールディング後に切断したSUMOが非共有結合でparkinと会合し、これがまだ除去しきれていなかった。そのため得られたNMRスペクトルにはSUMO由来のシグナルが混入していた。parkinと比較してSUMOの方が分子量が小さいため、SUMO由来のシグナルのほうがより強く観測されてしまった。

現在までの達成度 (段落)

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2018

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件)

  • [雑誌論文] Overview of Relaxation Dispersion NMR Spectroscopy to Study Protein Dynamics and Protein-Ligand Interactions.2018

    • 著者名/発表者名
      Walinda E, Morimoto D, Sugase K
    • 雑誌名

      Curr Protoc Protein Sci

      巻: 92 ページ: e57

    • DOI

      10.1002/cpps.57

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Resolving biomolecular motion and interactions by R2 and R1ρ relaxation dispersion NMR.2018

    • 著者名/発表者名
      Walinda E, Morimoto D, Sugase K
    • 雑誌名

      Methods

      巻: 148 ページ: 28-38

    • DOI

      10.1016/j.ymeth.2018.04.026

    • 査読あり

URL: 

公開日: 2019-12-27  

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