脂質性情報伝達物質を産生する膜タンパク質の脂溶性分子認識機構の解明

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H04343
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 吾郷 日出夫 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 専任研究員 (70360477)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 膜タンパク質 / 脂質メディエータ / X線結晶構造解析 / 放射光

研究実績の概要

平成28年度は界面活性剤で安定化したマイクロゾーマルプロスタグランジンE2合成酵素1（mPGES1）の結晶を用い脂溶性リガンドとの複合体構造解析を行った。リガンドとして、不飽和脂肪酸、プロスタグランジンアナログ、阻害能を異にする化合物等を用いた。１日から数日の浸漬の後、各リガンドで複数個の結晶についてX線回折実験を行い、X線回折強度データの各種統計値と結晶学的パラメータを対象に多成分解析を行った。リガンドを含まない溶液に浸漬した結晶（天然型結晶）もX線回折実験を行い解析に供した。主成分プロットでは、プロットが狭い領域に集中するリガンドと分散するものに分かれ、さらに前者はプロットが集中する位置が天然型結晶と近い物と離れた物に分けられた。天然型結晶と離れた場所にプロットが集中したリガンドでは、天然型結晶のX線回折強度データに比べ分解能やX線回折強度データの質を表す統計値が良好でありながら、リガンドの分子構造が判別できる明瞭さは無いもののFoFc差フーリエ電子密度図に残渣電子密度が多く見られ、精密化で用いた構造モデルで表現できない要素が天然型結晶のX線結晶構造解析に比べより多いことを示し、リガンドが結晶中のmPGES1と相互作用している可能性がより高いと考えられた。明瞭な電子密度とならなかった理由としてリガンドの占有率が低い場合や結合様式の不均一性などがある。より高濃度の脂溶性リガンドを扱える反面、結晶の大きさの制約のためマシンタイムが限られるマイクロビームビームラインでX線回折実験を行う必要性がより高くなるメソ相での実験の優先度が高いリガンドであると言える。この実験の過程でmPGES1に部位特異的に結合する水溶性リガンドを見出し、このリガンドの結合がmPGES1の構造を変化させること、また、酵素活性に影響を与えることを見出した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

結合様式を確定できる明瞭さで脂溶性リガンドの電子密度を観察できていない点が計画に比べて遅れているという判断をする理由である。本研究は極性基が相対的に少ない脂溶性リガンドを脂質性情報伝達物質の産生タンパク質が認識する仕組みを、複合体構造解析により理解しようとするものであり、その成功の一つの鍵は、産生タンパク質をいかにしてより高濃度のリガンドと共存させるかという点である。本課題では脂溶性リガンドと親和性が高いモノオレイン等の脂質様物質を結晶化の基材とすることでこの課題の解決を図っている。モノオレイン等の脂質様物質を結晶化の基材とする結晶化（in meso 結晶化）では、結晶の大きさがマイクロビームビームラインを用いなければX線回折強度データを収集できない小ささに留まることも多く、本研究で使用するタンパク質の結晶もX線回折強度測定にマイクロビームビームラインが必要な大きさである。マイクロビームビームラインはその数が極めて限られており利用機会が限られていることから、事前に測定試料の絞り込みを行うことが不可欠である。これ迄の所、通常のビームラインを使ったX線回折実験で脂溶性リガンドの絞り込みの段階にある。

今後の研究の推進方策

平成２９年度に有望であると判断した脂溶性リガンドを中心に、in meso 結晶化とマイクロビームビームラインでのX線回折強度データ測定を進め、脂溶性リガンドの認識機構を明らかにする。有機溶剤に溶かした脂溶性リガンドをモノオレインと均一に混合しこれを乾燥してin meso 結晶化の基材を作成する。mPGES1はすでに判明しているin meso 結晶化の条件周辺で結晶を作成する。これと並行してin surfo結晶化で得られる比較的大型の結晶を用い効率的にin meso結晶化を進めるため脂溶性リガンドの探索を行う。ロイコトリエン合成酵素の場合は現時点でin meso 結晶化条件が知られていないので、引き続き結晶化条件の探索を進める。