研究課題
概日時計は細胞に内在する約24時間周期の振動体であり、様々な生理活性に約24時間周期の概日リズムをもたらす。現在概日時計の発振機構として、概日時計遺伝子の転写・翻訳のネガティブフィードバックループモデルが広く受け入れられている。このモデルの反例として、2005年にシアノバクテリア概日時計蛋白質KaiCのリン酸化リズムが、3つの蛋白質KaiA、KaiB、KaiCをATPと混合することによりin vitroで再構成できることが報告されたが、真核生物においては未だにこのようなリズムは報告されておらず、転写・翻訳のネガティブフィードバックループが唯一の概日振動体であるという考え方が一般的である。本研究では哺乳類の組織、細胞を用いて、主にプロテオミクスの手法により約24時間周期で翻訳後修飾が日内変動を示す蛋白質を網羅的に探索し、その振動機構と生体内での機能を生化学およびケミカルバイオロジーの手法を用いて明らかにすることを目的とする。平成27年度はプロテオミクス解析の基盤整備を行った。翻訳後修飾の解析のため、質量分析装置にゲルフリーショットガンプロテオミクスシステム、リン酸化ペプチド高効率検出システム、ノイズ軽減システムを導入し、プロテオミクスに最適なシステムを構築した。また試料の前処理用にリン酸化ペプチド濃縮の完全自動化システムを稼働させた。試料調製に用いる細胞材料としては、ヒトU2OS細胞のpBmal1::lucレポーター株に、CRISPR-Cas9法を適用し概日時計遺伝子Bmal1およびCryを不活性化した株の作成を行った。一方、哺乳類の概日リズム中枢である視交叉上核(SCN)に由来する細胞株SCN2.2については、この株を樹立した研究者より分与を受け研究をすすめたが、現在は樹立当初と異なりSCNの性質を保持していることは形態的にも機能的にも確認できなかった。
2: おおむね順調に進展している
質量分析については、リン酸化ペプチドの解析システムの立ち上げが順調に進行した。リン酸化ペプチドの検出のためには前処理として濃縮が必須であるが、この過程を自動化できたことで多数の時系列サンプルを解析することが可能となった。また、nanoLC-MS/MS装置に2メートルロングカラム、バイオイナートデバイス採用によるリン酸化ペプチド高効率検出システム、クローズ式ナノスプレーソースデバイスを搭載することにより、ペプチドの分離、検出に大きな改善が見られ、高いS/N比で効率よくシグナルを検出することが可能となった。研究に必要な生物材料の調達については、おおむね順調に進行した。また蛋白質試料の調製法についても、当初予定していた全蛋白質試料に加え、必要に応じて細胞分画の過程を加えることが有効であることがわかった。一方、当初は概日時計中枢である視交叉上核由来の培養細胞株SCN2.2を用いて、ハイスループットのケミカルスクリーニングの系を立ち上げる予定であったが、当該細胞株が神経細胞の形質を保持していないことが判明したため、計画を変更することとなった。代替策として、ライブラリーのスクリーニングはU2OS細胞を用いてpBmal1::lucレポーター由来の発光を指標に行い、得られたヒット化合物についてSCNの組織培養系を用いてさらに研究を進めることとした。
平成28年度は培養細胞および組織より調製した蛋白質サンプルを用いて翻訳後修飾が概日リズムを示す蛋白質を探索する。細胞レベルにおいては、ヒトU2OS細胞のpBmal1::lucレポーター株およびまたこの株から作出した概日時計遺伝子破壊株から経時的に蛋白質試料を調製し、平成27年度に立ち上げを行った質量分析システムによりプロテオーム解析を行い、翻訳後修飾の中でも特にリン酸化状態が日内変動する蛋白質を網羅的に探索する。またこれらの株の結果を比較することで、転写・翻訳のフィードバックループと翻訳後修飾の関係について考察を進める。また時計遺伝子Clockに変異をもつマウスより肝臓の組織、および脳の視床下部背内側部近傍の組織を採取し同様の解析を進めることで、代謝リズムや光周性の制御に関与する非転写・翻訳型の振動体についても探索を行う。また、蛍光ディファレンシャル二次元電気泳動法およびiTRAQ法の検討も継続し、リン酸化以外の翻訳後修飾の日内変動についても研究を進める。概日時計中枢である視交叉上核由来のSCN2.2細胞株については、昨年度の研究によりSCNの性質を保持していないことが判明した。したがって今後は生体より採取したSCNの組織培養を用いて研究を進める。まずSCNの組織培養よりルシフェラーゼレポーターの発光リズム、神経細胞の自発発火リズムが観測できることを確認する。並行して電位感受性蛍光蛋白質ArcLightをSCNで発現するトランスジェニックマウスを樹立する。次にこのマウス由来のSCNの組織培養を行い、蛍光が自発発火リズムを反映できているか否かを検討する。当初計画していたケミカルライブラリーのスクリーニングは、現在ハイスループットの測定システムの立ち上げが完了しているUSOS細胞のpBmal1::lucレポーター株を用いて進めることとする。
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