繋留複合体とSNARE複合体の連動による小胞輸送の調節

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15H04370
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 中山 和久 京都大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (40192679)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 細胞・組織 / 細胞内タンパク質輸送 / タンパク質複合体

研究実績の概要

小胞輸送の最終ステップで起こる小胞膜と標的膜（エキソサートーシスの場合には細胞膜）の融合の特異性は、SNAREタンパク質の組合せによって決定されるというSNARE仮説が提唱されている。しかしこれまでの私たちの研究によれば、SNAREタンパク質間の認識は予想よりもはるかに曖昧であり、このような組合せだけで膜融合の特異性が決定されるとは考えにくい。一方、私たちは最近、小胞輸送の際に、繋留複合体のExocystがSNAREタンパク質と相互作用することによって、膜融合の特異性を決定する可能性を示すデータを得た。
平成27年度には、私たちが新たに開発したタンパク質間相互作用解析法（VIPアッセイ；Visible Immunoprecipitation Assay）を活用して、８つのサブユニットからなるExocyst複合体の複雑な構築様式を解明した。さらに、VIPアッセイを用いて、SNAREタンパク質のうちのSNAP-23とSNAP-25が、Exocyst複合体のサブユニットのうちのSec6とSec8にそれぞれ結合することを見出した。Sec6とSec8はExocyst複合体のうちでコアを形成するサブユニットである。さらに、siRNAを用いたノックダウン実験によって、SNAP-23、SNAP-25、およびこれらが結合する相手方のSNAREタンパク質であるVAMP2が、Exocyst複合体の下流でトランスフェリン受容体のリサイクリングの過程で、リサイクリング小胞と細胞膜の融合の過程を媒介することを証明した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

新たに開発したVIPアッセイを活用して、Exocyst繋留複合体の複雑な構築様式を解明するとともに、この複合体のサブユニットのSec6とSec8がSNAREタンパク質のSNAP-23とSNAP-25にそれぞれ結合することを証明した。さらには、SNAP-23、SNAP-25、およびこれらが結合する相手方のSNAREタンパク質であるVAMP2が、Exocyst複合体の下流でトランスフェリン受容体のリサイクリングの過程で、リサイクリング小胞と細胞膜の融合の過程を媒介することを証明した。これらのことから、本研究はおおむね順調に進展していると言える。

今後の研究の推進方策

平成28年度は次のような研究を行う予定である。
・Exocyst繋留複合体とSNAREタンパク質の相互作用様式の解明
これまでに、VIPアッセイを活用して、SNAREタンパク質のうちのSNAP-23とSNAP-25が、Exocyst複合体のサブユニットのうちのSec6、およびSec8とそれぞれ結合することを見出しているが、本年度は他のSNAREタンパク質のSNAP-29とSNAP-47がExocyst複合体のどのサブユニットと結合すのかをVIPアッセイによって明らかにする。
さらに、私たちが独自に改良したCRISPR/Cas9システムによって、SNAREタンパク質をノックアウトした細胞を樹立し、様々なレスキュー実験を行うことによって、Exocyst複合体とSNAREタンパク質がトランスフェリン受容体のリサイクリング輸送の最終過程において果たす役割の解明を目指す。

研究成果

• [雑誌論文] Modulation of primary cilia length by melanin-concentrating hormone receptor 1 (2016)
  • 著者名/発表者名: Hamamoto, A., Yamato, S., Katoh, Y., Nakayama, K., Yoshimura, K., Takeda, S., Kobayashi, Y. & Saito, Y.
  • 雑誌名: Cell. Signal. 巻: 28 ページ: 572-584
  • DOI: 10.1016/j.cellsig.2016.02.018
  • 査読あり
• [雑誌論文] Class I Arfs (Arf1 and Arf3) and Arf6 are localized to the Flemming body and play important roles in cytokinesis (2016)
  • 著者名/発表者名: Hanai, A., Ohgi, M., Yagi, C., Ueda, T., Shin, H.-W. & Nakayama, K.
  • 雑誌名: J. Biochem. 巻: 28 ページ: 572-584
  • DOI: 10.1093/jb/mvv088
  • 謝辞記載あり
• [雑誌論文] GM130 is a parallel tetramer in a flexible rod-like structure and N-terminally open (Y-shaped) and closed (I-shaped) conformations. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ishida, R., Yamamoto, A., Nakayama, K., Sohda, M., Misumi, Y., Yasunaga, T. & Nakamura, N.
  • 雑誌名: FEBS J. 巻: 282 ページ: 2232-2244
  • DOI: 10.1111/febs.13271
  • 査読あり
• [雑誌論文] Architectures of multisubunit complexes revealed by a visible immunoprecipitation assay using fluorescent fusion proteins. (2015)
  • 著者名/発表者名: Katoh, Y., Nozaki, S., Hartanto, D., Miyano, R. & Nakayama, K.
  • 雑誌名: J. Cell Sci. 巻: 128 ページ: 2351-2362
  • DOI: 10.1242/jcs.168740
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Phospholipid flippase ATP10A translocates phosphatidylcholine and is involved in plasma membrane dynamics. (2015)
  • 著者名/発表者名: Naito, T., Takatsu, H., Miyano, R., Takada, N., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 290 ページ: 15004-15017
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.655191
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] SNAP23/25 and VAMP2 mediate exocytic event of transferrin receptor-containing recycling vesicles. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kubo, K., Kobayashi, M., Nozaki, S., Yagi, C., Hatsuzawa, K., Katoh, Y., Shin, H.-W., Takahashi, S. & Nakayama, K.
  • 雑誌名: Biol. Open 巻: 4 ページ: 910-920
  • DOI: 10.1242/bio.012146
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] COPI-mediated retrieval of SCAP is crucial for regulating lipogenesis under basal and sterol-deficient conditions. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takashima, K., Saitoh, A., Funabashi, T., Hirose, S., Yagi, C., Nozaki, S., Sato, S., Shin, H.-W. & Nakayama, K.
  • 雑誌名: J. Cell Sci. 巻: 128 ページ: 2805-2815
  • DOI: 10.1242/jcs.164137
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] ATP11C mutation is responsible for the defect in phosphatidylserine uptake in UPS-1 cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takada, N., Takatsu, H., Miyano, R., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
  • 雑誌名: J. Lipid Res. 巻: 56 ページ: 2151-2157
  • DOI: 10.1194/jlr.M062547
• [学会発表] ホスファチジルセリン取り込み異常のCHO-K1変異株（UPS-1）におけるflippaseの発現解析． (2015)
  • 著者名/発表者名: 高田直人、高津宏之、宮野吏永、中山和久、申惠媛
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Bの構築様式とCLUAP1の機能の解明． (2015)
  • 著者名/発表者名: 寺田将也、加藤洋平、野崎梢平、武井領汰、中山和久
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 中心体/基底小体で複合体を形成するRabL2とCep19の機能の解析． (2015)
  • 著者名/発表者名: 西島侑哉、萩谷遥平、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体から小胞体への逆行輸送による脂質代謝の調節． (2015)
  • 著者名/発表者名: 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申惠媛、中山和久
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] Visible immunoprecipitation（VIP）アッセイによるExocyst複合体の構築様式の解明． (2015)
  • 著者名/発表者名: 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [学会発表] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体-小胞体間の逆行輸送による脂質代謝調節． (2015)
  • 著者名/発表者名: 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申 惠媛、中山和久
  • 学会等名: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [学会発表] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性および細胞膜ダイナ ミクスへの関与． (2015)
  • 著者名/発表者名: 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申 惠媛
  • 学会等名: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [学会発表] Architectures of the BBSome, IFT-B, and Exocyst Complexes Revealed by Visible Immunoprecipitation (VIP) Assay Using Fluorescent Fusion Proteins. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakayama, K., Katoh, Y., Nozaki, S., & Terada, M.
  • 学会等名: FASEB Science Research Conference, “Biology o f Cilia and Flagella”
  • 発表場所: Snowmass Village, Colorado,
  • 年月日: 2015-07-19 – 2015-07-24
  • 国際学会
• [学会発表] Visible immunoprecipitation (VIP) アッセイによるマルチサブユニット複合体の構築様式の解明 (2015)
  • 著者名/発表者名: 加藤洋平、野崎梢平、寺田将也、中山和久
  • 学会等名: 第67回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-06-30 – 2015-07-02
• [学会発表] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性及び細胞膜ダイナミクスへの関与． (2015)
  • 著者名/発表者名: 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申惠媛
  • 学会等名: 第62回日本生化学会近畿支部例会
  • 発表場所: 草津
  • 年月日: 2015-05-16