| 研究課題/領域番号 |
15H04384
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
久堀 徹 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (40181094)
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| 研究分担者 |
原 怜 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (70624815)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | レドックス可視化 / チオレドキシン / 酸素 / 活性酸素 |
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| 研究実績の概要 |
光合成の制御に特に重要な要素である「還元力の分配機構」を理解するためには、生体内酸素濃度の動態、光合成系に関わる酵素のレドックス動態、非光合成条件下で酸化に関わる因子の動態、さらには、レドックス調節の主役であるチオレドキシンの動態など、電子の流れ情報が必須である。そこで、本年度も以下の5項目について研究を実施した。①光合成生物のレドックス応答タンパク質の動態のリアルタイムの解析については、緑色植物ミトコンドリアのレドックスタンパク質であるリンゴ酸脱水素酵素の活性制御の分子機構を解明した。また、緑色植物とシアノバクテリアにおける新規レドックス制御タンパク質NTRCの機能解析を行った。その結果、緑色植物葉緑体では、従来知られているチオレドキシンとNTRCがそれぞれ独立に還元力伝達経路を持っており、生存に重要な役割を果たしていること、シアノバクテリアでは抗酸化ストレスシステムの維持にNTRCが重要な役割を果たしていることを明らかにした。②光合成生物の細胞内レドックス動態のリアルタイム解析については、新規のレドックス応答蛍光タンパク質を開発し、植物細胞内への導入を試みた。③レドックス関連小分子の動態解析については、還元型グルタチオンの生体内での機能解析を行った。④チオレドキシンのレドックスに応じた動態のリアルタイム解析では、前年度に引き続き、ヒメツリガネゴケへのチオレドキシン-蛍光タンパク質融合タンパク質を導入し、アンピシリン培地での巨大葉緑体の作成による葉緑体内での観察を実施した。⑤植物細胞内の酸素濃度測定系の開発では、新規に細菌ヘムタンパク質とGFPの融合タンパク質を設計し、フォトクロミックFRETの原理による高感度酸素測定を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①光合成生物のレドックス応答タンパク質の動態のリアルタイム解析については、NTRCやチオレドキシンなど既知のタンパク質、および、これらから電子を受け取るタンパク質群の解析については順調に研究が進展し、それぞれについて論文発表を行った。一方、葉緑体内のレドックス応答タンパク質の網羅的な解析については、明条件で還元されるシステイン残基の適切な化学標識方法、および、この標識に基づくタンパク質の捕捉方法など、研究手法の開発に手間取っており、まだ成果を上げるには到っていない。②光合成生物の細胞内レドックス動態のリアルタイム解析では、新規に還元によって蛍光が消光するタンパク質、および、酸化状態と還元状態で蛍光スペクトルが変化するタンパク質の開発に成功したため、これらを光合成生物の細胞内に導入することにより、リアルタイム観察する実験系を開発中である。③については、グルタチオンに着目し、酸化的修飾を受けた酵素の再還元に働くシステムの存在を動物細胞で確認した。④では、葉緑体自家蛍光の影響を無視できる程度に蛍光強度の強いチオレドキシン－GFP融合タンパク質を発現するヒメツリガネゴケ形質転換体が未だに得られないため、導入するタンパク質の基本設計を再度検討中である。⑤については、新規に設計したフォトクロミックFRETによる高感度酸素測定蛍光分子の基本設計を終えた。
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| 今後の研究の推進方策 |
①光合成生物のレドックス応答タンパク質の動態のリアルタイム解析については、葉緑体内のレドックスタンパク質の網羅的な解析について、明暗条件でのタンパク質標識の工夫、状態の異なるタンパク質の捕捉法の開発を行う。②光合成生物の細胞内レドックス動態のリアルタイム解析では、新規に開発した酸化還元応答タンパク質を光合成生物細胞内に導入することで、光条件の変化に応じた細胞内の状態変化の観察を進める。③については、細胞内グルタチオンの還元レベルを阻害剤などによって変化させ、標的酵素の酸化的修飾を検出することで、細胞内グルタチオンレベルが標的酵素の酸化的修飾を制御していることを明らかにする。④では、GFPに融合するタンパク質としてこれまでのチオレドキシンだけでなく、他の酸化還元応答タンパク質を融合したタンパク質の設計を進め、これをヒメツリガネゴケに形質転換することで、蛍光強度が十分な形質転換体を得る試みを続ける。⑤については、細菌の酸素結合ヘムタンパク質と蛍光タンパク質の接続部分の配列を検討し、酸素の有無による蛍光変化がより大きな酸素測定蛍光分子、および、酸素に対する親和性を変化させることで測定のダイナミックレンジが異なる酸素測定蛍光分子の開発を進める。
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