| 研究課題/領域番号 |
15H04455
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
佐野 輝男 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (30142699)
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| 研究分担者 |
種田 晃人 弘前大学, 理工学研究科, 准教授 (70332492)
葛西 厚史 弘前大学, 農学生命科学部, 研究員 (80633982)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ウイロイド / RNAサイレンシング / DCL2 / DCL4 / ジベレリンβ水酸化酵素 / マイクロRNA |
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| 研究実績の概要 |
DCL2と4をRNAiでノックダウンしたトマトhpDCL2/4i-72E系統ではPSTVdの初期感染濃度が高く、激しい矮化・葉巻・全身壊疽が現れた。NGS解析の結果、72Eでは野生型に比べPSTVd-sRNAのサイズ分布が激変し、21-nt種は約30%、22-nt種は95%以上減少し、24-nt種は10倍以上増加した。MiRNA発現量も変動し、特にmiR398a-3pとmiR398は6～7倍に増加した。トマト5品種のDCL2と4遺伝子の発現量とPSTVd感受性を調査した結果、耐性品種のDCL2遺伝子に塩基の挿入と欠失が認められたが、各遺伝子の発現量と相関しなかった。
PSTVdの標的候補ジベレリンβ水酸化酵素遺伝子をRNAiでノックダウンしたトマトhpGibHi 1-1系統にPSTVdを接種した結果、野生型に比べ感染が約1週間遅れたが、病徴は激化し、激しい葉巻、黄化、脈壊疽症状が観察された。分子系統解析の結果、本遺伝子はGA代謝関連及び2ODDs群酵素遺伝子の中でGA 7ox或いはF3H遺伝子と近縁で、最新のBLAST検索の結果、べと病菌抵抗性DLO2遺伝子と相同であった。また、本遺伝子にはPSTVd-sRNA-21-118Pの標的となりうる配列が存在することから、amiRNA法で分析したが、RNAiで切断される可能性は示唆されなかった。
miR159とmiR319の疑似標的配列を発現する各3系統の形質転換トマト系統を分析した結果、全系統で導入遺伝子は確認されたが、発現は検出レベル以下であった。全系統にPSTVdを接種したが、対照区と比べて感受性と病徴の激しさに違いはなかった。
4系統のPSTVd特異的small RNAのヘアピンRNAを発現する形質転換トマトを選抜した。hpPSTVd-113P系統はPSTVdに高感受性となり、野生型には見られない激しい矮化、葉巻症状が見られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
RNAサイレンシングのキー因子をRNAiでノックダウンした形質転換トマトからhpDCL2/4i-72E、hpRDR6i-91B、hpAGO2i-81Iの3系統、ジベレリンβ水酸化酵素遺伝子をRNAiでノックダウンした形質転換トマトからhpGibHi-1-1を選抜し、ウイロイド感受性、miRNA発現量、ジベレリンβ水酸化酵素遺伝子発現量に関する分析・評価が完了し、期待通りジベレリンβ水酸化酵素遺伝子の発現量低下とPSTVd病徴の激しさが相関することを確認した。また、miR159とmiR319の疑似標的配列を発現する形質転換トマトMIM159とMIM319の導入遺伝子発現解析とウイロイド感受性の分析・評価が完了した。さらに、6種類の主要なPSTVd-sRNA配列のヘアピンRNAを発現する形質転換トマトのうち、遺伝子導入が確認された5系統のPSTVd感受性試験が完了し、hpPSTVd-113P系統がPSTVdに高感受性になる現象を見出した。本来この実験はRNAiによるPSTVd耐性付与を目指すものであったが、全く逆の想定外の現象が観察された。ウイロイドの病原性に関する新たな機構の発見につながることが期待される。
PSTVdに感染したDCL2/4ノックダウントマト系統中のスモールRNAのNGS解析が完了し、PSTVd-sRNAのサイズ分布が劇変すること、miRNAの中で特にmiR398とmiR398a-3pが病徴の激化と相関して劇的に増加するという新たな展開につながる新知見を得ることができた。
初年度の結果に基づきPSTVd感受性の異なるトマト5品種のDCL2、4発現量の違いを分析した。
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| 今後の研究の推進方策 |
PSTVd感染hpDCL2/4i-72は激しい黄化と全身壊死を現し、PSTVd-sRNAとmiRNAが劇的に変化し、特にmiR398とmiR398a-3p発現量が6～7倍に増加した。miR398は2種類の銅/亜鉛スーパーオキシダーゼジスムターゼ（Cu/Zn SODs）を制御するmiRNAで、SODsは細胞内に発生した活性酸素を分解する酵素である。SODsに銅を供給して成熟を促すシャペロンCCS1のmRNAにはmiR398a-3pの標的配列が存在するので、miR398a-3pの発現上昇とCCS1遺伝子変化及びhpDCL2/4i-72Eに発症する全身壊疽の謎を解明する。
PSTVd強毒型と弱毒型は9塩基異なる。各変異を1つずつ相互に入れ替えた変異体分析から、強毒型の第42番塩基Cを弱毒型Uに変えると弱毒化した。もしPSTVd-sRNAが病原性に関与すると仮定すると、42番塩基を含むPSTVd-sRNAが重要な働きを担うと予想される。PSTVdの強毒型と弱毒型に感染した感受性トマトのスモールRNAのNGSデータの分析から42番塩基を含む主要なPSTVd-sRNAは8種類あったが、中でもPSTVd-21-24Mは発現量も多く、トマトの予想E3ユビキチンプロテインリガーゼ（UBR7）mRNA中に標的候補配列を有していた。amiRNA法を用いてPSTVd-21-24MがUBR7-mRNAの標的候補配列をRNAiで切断する可能性を検討する。
PSTVd＋鎖の113番～133番から生じるPSTVd-sRNAのヘアピンRNAを発現する形質転換トマトhpPSTVd-113PはPSTVdに高感受性になり、野生型には見られない激しい矮化、葉巻症状を現すことが判明した。本系統の病徴発現を詳細に観察評価し、PSTVd増殖量、miRNA、植物ホルモン生合成、防御関連遺伝子群の発現変化を分析する。
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