| 研究課題/領域番号 |
15H04458
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
一瀬 勇規 岡山大学, その他の研究科, 教授 (50213004)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 菌体密度感知機構 / アシルホモセリンラクトン / PsyR / 転写制御 / タイプIII分泌システム / Hrp |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではタバコ野火病菌Pseudomonas syringae pv. tabaci 6605 (Pta 6605)とインゲン褐斑細菌病菌P. syringae pv. syringae B728a (Psy B728a)の菌体密度感知システムの制御機構と、菌体密度感知システムによるhrpタイプIII分泌システム(T3SS)関連遺伝子の発現制御機構を解析する。研究の方法としては、菌体密度感知システムの転写因子PsyRのDNA結合解析とPta 6605とPsy B728aのpsyRの欠損変異株やpsyRの入替え株の解析による。本年度はPsyRの生化学的解析を推進するために、まず両菌由来のPsyRタンパク質を大腸菌を用いて発現させた。pET16bを用いたHisタグとの融合タンパク質の場合、多くが不溶性となったが、pMAL-c5X-Hisを用いた可溶性のマルトース結合タンパク質(MBP)とHisタグとの融合タンパク質として発現させた場合、可溶性の融合タンパク質して精製に成功した。DNA-タンパク質の結合実験はゲルシフトアッセイで実施した。バンドの検出法としてDIGラベルしたプロモーター断片を抗体で発光検出するDIG抗体法と、SYBR GreenによるDNA検出を原理とする抗体を用いない簡便な蛍光検出法（SG法）の2つを用いた。どちらの方法によってもPsyRと対応するpsyIプロモーターとの結合が確認された。また、PsyRとhrpT3SS関連遺伝子の転写制御遺伝子hrpLにも結合を確認した。一方、psyRの遺伝学的解析として、Pta 6605とPsy B728aの両菌株でpsyRpsyIの二重変異株の作出に取りかかるとともに、菌体密度感知システムの推定票的遺伝子であるmexEFoprN遺伝子の発現をβ-ガラクトシダーゼ活性でモニターできる菌株の作出を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
菌体密度感知システムの転写制御因子であるPsyR の生化学的解析を実施するために必須のPsyR組換えタンパク質の生産システムをpMAL-c5X-Hisベクターを用いることで構築できた。PsyR組換えタンパク質とプロモーターとの結合実験では、DIG抗体法と、SYBR GreenによるDNA検出を原理とする抗体を用いない簡便な蛍光検出法（SG法）を実施して、双方でシフトバンドを確認しそれぞれの利点を確認した。一方、菌体密度感知システムの遺伝学的解析として、Pta 6605とPsy B728aの両菌でpsyR、psyIの各変異株を整理すると同時に、psyRpsyIの二重変異株、ヘテロな組合せを含めたpsyRの相補株作出の準備をした。また、菌体密度感知システムの標的遺伝子候補であるmexEFoprN遺伝子にレポーター遺伝子産物であるβ-ガラクトシダーゼ活性でモニターできる系の作出が進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
菌体密度感知システム転写因子であるPsyRの大腸菌を用いた大量発現系は構築できた。また、DNA-タンパク質結合実験はDIG抗体法と、SYBR GreenによるDNA検出を原理とする抗体を用いない簡便な蛍光検出法（SG法）の双方で可能なことが判明した。今後は、PsyRの結合したプロモーター断片を分断したり、部位特異的な変異を導入して結合に必要なコア配列を同定する。また、PsyRとDNAとの結合に及ぼすアシルホモセリンラクトンの影響を解析する。更に、Pta 6605とPsy B728aのそれぞれのpsyR遺伝子を入れ替えて、表現型、特にT3SS遺伝子発現に及ぼす影響を解析する。T3SS遺伝子発現の解析にはlacZYAレポーター遺伝子を用いて、簡便な測定系を開発・利用する。
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