| 研究課題/領域番号 |
15H04462
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
手林 慎一 高知大学, 自然科学系, 准教授 (70325405)
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| 研究分担者 |
間世田 英明 徳島大学, ソシオテクノサイエンス研究部, 准教授 (10372343)
及川 彰 山形大学, 農学部, 准教授 (50442934)
石原 亨 鳥取大学, 農学部, 教授 (80281103)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | イネ / オカボノアカアブラムシ / セロトニン / 褐変 |
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| 研究実績の概要 |
オカボノアカアブラムシ(以下アブラムシ)がイネ根に寄生すると誘導抵抗性として褐変が生じる。ところが褐変物質の前駆体であるセロトニンの蓄積が不自然に遅延し、アブラムシの寄生後2～4日間は低い濃度にとどまる。低濃度のセロトニンがアブラムシの生育を促進することを確認したことから、アブラムシはイネの防御反応を抑制することで抵抗性を弱めるばかりか、さらにこの抵抗性物質を逆手にとり自身の増殖に積極的に利用している可能性が示唆された。本研究ではこのアブラムシによるイネの誘導抵抗性を抑制する機構を分子生物学的・生物有機化学的に解明することを目的とした。H27年度はアブラムシがイネ根に寄生した際の、植物における代謝産物動態の分析を行うとともに、植物ホルモンや遺伝子の発現動態の網羅的な解析の準備を行った。
イネ根における代謝産物のCE-TOFMSによる詳細な分析結果から、セロトニンの蓄積がアブラムシの寄生後2～4日間は低い濃度にとどまることが再確認され、前述の現象はイネ根の抵抗性をアブラムシが恒常的に抑制することでイネ根の栄養状態を改善する適応戦略であることが判明した。さらにこの期間、アミノ酸の蓄積量は大きくは変動しないことからアブラムシはイネの代謝経路を選択的に抑制する能力をもつことが新たに判明した。
またマイクロアレイによる遺伝子発現の網羅的解析のための抽出・精製・分析技術の最適化を行うとともに、植物ホルモン類のLC-MSMS(MRM)による一斉分析条件の最適化を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マイクロアレイによる遺伝子発現の網羅的な解析を行うためにイネ根からのtotal-RNAの抽出・精製方法の諸条件の検討を行い、イネ根約20 mgから、濃度65 ng/uL以上、純度RIN値8.5以上のtotal-RNAを18 uL調整するスキームの確立を行った。即ち、イネ根約20 mgを破砕機(2200 rpm)とキット(RNeasy Plant Mini Kit)を用いて抽出し、RNase free-DNaseでDNAを分解した後、定法により精製するスキームを開発した。さらに得られたtotal-RNAをバイオアナラオザーを用いて純度の検討を行うとRIN値9.0前後の純度であったことから、このtotal-RNAとキット(Affymetrix)を用いてcRNAを経てss-cDNAを合成し、短断片化した後にDNAマイクロアレイ(Affymetrix Rice(Jp) Gene Array 1.1 ST Strip)にハイブリダイゼーションさせ、マイクロアレイスキャナで読み取ることで遺伝子発現の網羅的な解析を行えることを確認した。これらの技術を用いて今後、経時的なイネ根における遺伝子発現解析を行うことが可能となった。
また、植物の代謝産物の網羅的な解析は既にCE-TOFMSによる分析技術が確立しているものの、病害抵抗性に関与する植物ホルモン分析の分析方法は未確立であった。そこでサリチル酸グルコシド(SAG)を合成するとともに、３種の植物ホルモン（サリチル酸(SA)、SAG、アブシジン酸(ABA)）のLC-MSMS(MRM)での分析条件の検討を行い最適化に至っている。このことから今後イネ根におけるホルモン変動の経時的な解析が可能となった。
以上のことから本研究は概ね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
オカボノアカアブラムシがイネの根に寄生した際にどのようにセロトニンの蓄積を抑制させ、どのように自身の生存環境を改善しているかを解明するために、既に構築した研究協力体制により次の項目を実施し、セロトニン蓄積抑制経路の推定を目指す。
植物試料調整方法：イネ幼苗（日本晴）およびオカボノアカアブラムシを準備し、人工気象器にてアブラムシの寄生したイネ根を準備する。得られたイネの根を各種測定の試料に供する。
マイクロアレイ解析：現在までにイネ幼根からキットを用いてTotalRNA の抽出方法と、DNAマイクロアレイ法による網羅的な遺伝子発現量の解析方法は確立している。本年はアブラムシが加害後のイネ根における経時的な遺伝子発現量の測定を行う予定であり、得られたデータは専用のソフトウェアでネットワーク解析を行い、目的遺伝子の特定を行う。特にセロトニンの係る生合成経路に関わる解糖系・TCA回路の代謝酵素に関する遺伝子の発現量に重点をおき、詳細な解析を行う予定である。
メタボローム解析：極微量の試料からアミノ酸を検出するためにCE-TOFMS分析を引き続き行う。分析はAgilent G3250AA LC/MSD TOF systemを用いて既に最適化された方法で行う。得られたデータは専用のソフトウェアで発現動態解析を行い、セロトニン蓄積の抑制機構を推定する。
Real-time PCR解析：既に確立している方法を用い、RNAを調整したのち、逆転写酵素を用いてcDNAのライブラリーを作製し、最適化されたプライマーとPCR用マスターミックスを用いてcDNAを合成し、その増加曲線からRNAの転写量を測定する。これによりターゲット遺伝子の詳細な発現動態を分子生物学的に解析する。
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