| 研究課題/領域番号 |
15H04530
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
今井 友也 京都大学, 生存圏研究所, 准教授 (90509142)
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| 研究分担者 |
岩崎 憲治 大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (20342751)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | セルロース合成酵素複合体 / クライオ電子顕微鏡 / 膜タンパク質精製 |
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| 研究実績の概要 |
セルロース合成酵素複合体として引き続き酢酸菌をモデルとして選択して実験を進めた。機能上最小構成単位であるCesA・CesBタンパク質に加えて、さらにCesCタンパク質とCesDタンパク質を含めたより完全形に近いCesABCD複合体も実験試料に加えて、複合体精製を行った。
まず大腸菌での発現条件最適化の結果、自動誘導法がCesABおよびCesABCD複合体の共発現に有効であることが判明した。すなわち自動誘導により発現量が増加することが、CesABとCesABCDの両方において観察された。
そこで自動誘導法を使ってCesABおよびCesABCDタンパク質を発現し、精製実験へ供した。精製に用いる界面活性剤を何種類かテストし、いくつか使用できる界面活性剤の候補を選定した。これらの界面活性剤を使って金属アフィニティ精製を行ったところ、CesABとCesABCD両者においてサブユニット解離を抑えた状態で精製できる可能性を見出した。
特にCesABCDタンパク質複合体の精製は、CesDのC末にHisタグを融合したコンストラクトを使ったところ、抗体でようやく検出できるレベルではあるが、CesDとともにCesA、CesBおよびCesCを共精製できることが確認された。一方でN末HisタグのCesDを使った場合では、CesAは抗体で検出できるレベルで共精製できたが、CesBとCesCは共精製できなかった。
また興味深いことに、SDS-PAGE上でCesDの挙動がタグの位置によって異なることが判明した。おそらくHisタグの位置がCesDのホモ会合体の状態に影響を及ぼしたと考えられる。すなわちCesDタンパク質の会合体構造がCesABCD複合体形成にも影響を及ぼしていることが、間接的だが示唆される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究の目標であるクライオ電子顕微鏡法による構造解析のためには、良質なタンパク質試料調製のための精製プロトコルの確立が必須である。しかし現時点で、セルロース合成酵素のフル複合体精製のための発現系構築や、実験に使用可能な変異体タンパク質の選抜、タンパク質精製条件の絞り込みは進みつつあり、研究開始前よりも進歩していることは間違いないが、まだクライオ電子顕微鏡観察によるデータ取得に至る道筋までは見えていないことから、やや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
「6.研究実績の概要」欄で記述した通り、CesABおよびCesABCD複合体を精製できる可能性が見えてきたので、引き続きタンパク質精製条件最適化を行い、より純度の高い複合体タンパク質試料を得るための精製条件確立を目指す。ある程度精製が進んだところで負染色法による観察を行い、ランダムコニカルティルト法による初期構造の構築あるいはクライオ電子顕微鏡による観察を行い、三次元再構成用のデータを取ることが適当な試料であれば、構造解析計算へと進む。
以上の構造生物学による直接的なアプローチに加えて、生化学的なアプローチ（免疫沈降法や密度勾配遠心法）、あるいは顕微鏡法（凍結割断レプリカ－免役ラベル法）によるアプローチも加えて研究を進める。セルロース合成酵素は複数の分子からなる複合体であることから、個々のサブユニットの立体構造（三次構造）だけでなく、サブユニット間の配置といった四次構造も、セルロース合成機能を理解する上で重要な情報であり、以上の生化学的な解析結果も含めて包括的にセルロース合成酵素複合体の全貌解明を目指す。
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