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2017 年度 実績報告書

バイオイメージング法によるテトロドトキシンと輸送タンパク質の動態解析

研究課題

研究課題/領域番号 15H04550
研究機関東京海洋大学

研究代表者

長島 裕二  東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (40180484)

研究分担者 永井 慎  岐阜医療科学大学, 保健科学部, 准教授 (30460497)
松本 拓也  県立広島大学, 生命環境学部, 助教 (30533400)
研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2019-03-31
キーワード水産学 / 生体分子 / テトロドトキシン / バイオイメージング
研究実績の概要

本研究は、フグの毒化機構解明のため、1)放射性テトロドトキシン(TTX)を用いたSPECT/PETバイオイメージング法によるTTXの可視化検出法を確立し、2)TTXの体内輸送にかかわるタンパク質の特性と機能の解明を行い、3)フグ体内におけるTTXの動態を明らかにすることを目的としている。
1)放射性TTXを用いたSPECT/PETバイオイメージング法によるTTXの可視化では、これまで放射性TTXの合成について検討し、今年度は、TTXにヨウ素またはテクネシウムを付加した放射性TTXを合成した。元素付加したTTXの物理化学的性状を調べるため、非放射性ヨウ素を付加したTTXを合成して薬剤安定性、光分解、収着および吸着試験を実施し、TTX合成品はTTX標準品と同様の性状を示すことを確認した。
2)TTX輸送運搬タンパク質では、本研究で、ヒガンフグ卵巣においてフグ毒の一部は卵黄タンパク質ビテロゲニン類似タンパク質と結合していることを明らかにしたことを受け、TTXがフグ卵巣のビテロゲニンと結合するか否か調べた。卵巣からのビテロゲニン精製法を検討した後、ヒガンフグから精製したビテロゲニンはTTXと結合することを平衡透析法で確認した。
TTX取り込みトランスポーターに関しては、TTXを輸送すると予想される有機カチオン/カルニチントランスポーターOCTN2をコードするslc22a5遺伝子をクローニングした。本遺伝子のcDNAは全長2,122 bpで、フグゲノムデータベースのchromosome 15に12のエクソンとして存在すると推定された。翻訳領域には554アミノ酸からなるOCTN2のタンパク質がコードされていた。RT-PCR法でトラフグ組織における発現分布を確認したところ、本遺伝子は、脳、腸、肝臓および腎臓に発現していることが明らかになった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

1)放射性TTXを用いたSPECT/PETバイオイメージングに関しては、ヨウ素またはテクネシウムを付加した放射性TTXを合成した。合成されたTTXは凝集、分解、吸着等が懸念されるため、非放射性ヨウ素を付加したTTXを用いて、安定な溶解液を検討し、薬剤安定性、光分解、収着および吸着試験を実施した。その結果、TTX合成品はリン酸二カリウムや炭酸塩等を配合した溶解液中で安定で、TTX標準品と同様の性状を示すことを確認した。
2)TTX輸送運搬にかかわるタンパク質に関しては、これまでに、ヒガンフグ卵巣からフグ毒結合タンパク質を単離し、ビテロゲニン類似タンパク質であることを明らかにした。そこで、ビテロゲニン類似タンパク質とTTXの結合活性を調べるため、まず、市販の抗サケビテロゲニンポリクロナル抗体を用いて、魚類卵巣から効率的なビテロゲニン精製法を検討した。次に、精製したヒガンフグのビテロゲニンとTTXの結合を平衡透析法で調べ、TTXはビテロゲニンに結合することを明らかにした。
TTX取り込みトランスポーターに関しては、これまでに、次世代シーケンスアーカイブを利用して、トラフグの肝臓に発現していると推定される有機カチオントランスポーターの推定塩基配列をトラフグゲノムデータベースから候補遺伝子を選択した。それらの塩基配列情報をもとに、トラフグの肝臓から、TTXを輸送すると予想される有機カチオン/カルニチントランスポーターOCTN2をコードするslc22a5遺伝子をクローニングした。全長cDNA配列の長さは2,122 bpで、翻訳領域には12ヶ所の膜貫通ドメインを有する554アミノ酸からなるOCTN2のタンパク質がコードされていた。RT-PCR法において、本遺伝子はトラフグの脳、腸、肝臓および腎臓に発現していることを明らかにした。

今後の研究の推進方策

1)TTXの可視化検出のための放射性TTXを用いたSPECT/PETバイオイメージング法に関しては、トラフグに放射性TTX合成品を投与して、TTXの体内動態をイメージングで観察する。具体的には、肝門脈にカテーテルをつなぎ、そこから放射性TTX合成品を投与する。経時的に観察を行い、得られた動態画像からトラフグ体内におけるTTX動態を詳細に検討する。
2)TTX輸送運搬タンパク質に関しては、TTXをもたない魚種の卵巣(入手しやすいサケ(いくら)またはスケトウダラ(たらこ)を予定)からビテロゲニンを抽出、精製してTTXとの結合性を調べ、ビテロゲニンのTTX結合がフグに特異的か検討する。
TTX取り込みトランスポーターに関しては、トラフグOCTN2のTTX輸送活性を確かめるため、トラフグのOCTN2遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製し,これをイヌ腎臓由来MDCKII細胞に形質導入して,OCTN2タンパク質を過剰発現する培養細胞を作製する。そのトランスポーター発現細胞を用いてTTXの輸送試験を実施する。そして、OCTN2トランスポーターの代表的な基質であるL-カルニチンを用いてTTXの輸送が競争阻害されるか試験する。また、TTX輸送に関与すると考えられる有機カチオントランスポーターOCT6をコードするslc22a16遺伝子についてもクローニングを行い、全長cDNA配列の解明、組織発現分布ならびにMDCKII細胞を用いた発現細胞の作製を試みる。

  • 研究成果

    (18件)

すべて 2018 2017 その他

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (13件) (うち国際学会 3件、 招待講演 3件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] Effect of St John’s Wort on the pharmacokinetics and expression of cytochrome P4502018

    • 著者名/発表者名
      M. Nagai, K. Inagaki
    • 雑誌名

      Med. Nurs. Environm. Sci.

      巻: 1 ページ: 18-25

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] A novel function of vitellogenin subdomain, vWF type D, as a toxin-binding protein in the pufferfish Takifugu pardalis2017

    • 著者名/発表者名
      1)X. Yin, A. Kiriake, A. Ohta, Y. Kitani, S. Ishizaki, Y. Nagashima
    • 雑誌名

      Toxicon

      巻: 136 ページ: 56-66

    • DOI

      10.1016/j.toxicon.2017.06.006

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Urinary excretion of tetrodotoxin modeled in a porcine renal proximal tubule epithelial cell line, LLC-PK1.2017

    • 著者名/発表者名
      T. Matsumoto, Y. Ishizaki, K. Mochizuki, M. Aoyagi, Y. Mitoma, S. Ishizaki, Y. Nagashima
    • 雑誌名

      Marine Drugs

      巻: 15 ページ: -

    • DOI

      10.3390/md15070225

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 熊野灘産ムシフグの毒性2018

    • 著者名/発表者名
      辰野竜平,梅枝真人,宮田祐実,出口梨々子,福田 翼,古下 学,高橋 洋,長島裕二
    • 学会等名
      平成30年度日本水産学会春季大会
  • [学会発表] 組織培養法による巻貝のテトロドトキシン取り込みと排出2018

    • 著者名/発表者名
      大木理恵子,松本拓也,石崎松一郎,長島裕二
    • 学会等名
      平成30年度日本水産学会春季大会
  • [学会発表] ヒライソガニ体液に含まれる麻痺性貝毒変換物質の性状解明2018

    • 著者名/発表者名
      横塚峻介,木谷洋一郎,鈴木信雄,林 華娟,石崎松一郎,長島裕二
    • 学会等名
      平成30年度日本水産学会春季大会
  • [学会発表] トラフグのカルニチントランスポーターoctn2をコードするslc22a5遺伝子のクローニング2018

    • 著者名/発表者名
      松本拓也,高橋晶子,青栁 充,大竹才人,三苫好治,石崎松一郎,長島裕二
    • 学会等名
      平成30年度日本水産学会春季大会
  • [学会発表] TTX と Na+ channel におけるインシリコ解析2018

    • 著者名/発表者名
      永井 慎
    • 学会等名
      第32回マリントキシン研究会
    • 招待講演
  • [学会発表] 放射性標識をした核酸医薬品の設計モデリングと機能性評価2018

    • 著者名/発表者名
      永井 慎,片渕哲朗
    • 学会等名
      第138回日本薬学会大会
  • [学会発表] 日本海西部沿岸より採取されたカニ類の毒性2017

    • 著者名/発表者名
      土井啓行,岡山桜子,徐 超香,長島裕二
    • 学会等名
      日本海甲殻類研究会第16回発表会
  • [学会発表] フグの毒とフグ食の安全性2017

    • 著者名/発表者名
      長島裕二
    • 学会等名
      ジャパン・インターナショナル・シーフードショウ 国際ふぐ協会セミナー
    • 招待講演
  • [学会発表] In vitro uptake of tetrodotoxin into marine gastropods by tissue culture2017

    • 著者名/発表者名
      R. Ohki, T. Matsumoto, S. Ishizaki, Y. Nagashima
    • 学会等名
      日本水産学会創立85周年記念国際シンポジウム
    • 国際学会
  • [学会発表] Bio-transformation of paralytic shellfish toxin by the hemolymph of shore crab Gaetice depressus.2017

    • 著者名/発表者名
      S. Yokozuka, Y. Kitani, N. Suzuki, S. Ishizaki, Y. Nagashima
    • 学会等名
      日本水産学会創立85周年記念国際シンポジウム
    • 国際学会
  • [学会発表] Carrier-mediated transport of tetrodotoxin in porcine renal proximal tubule epithelial cell line LLC-PK1 monolayer2017

    • 著者名/発表者名
      T. Matsumoto, Y. Ishizaki, K. Mochizuku, M. Aoyagi, Y. Mitoma, S. Ishizaki, Y. Nagashima
    • 学会等名
      日本水産学会創立85周年記念国際シンポジウム
    • 国際学会
  • [学会発表] ボウシュウボラおよびキンシバイによるフグ毒中毒リスク評価2017

    • 著者名/発表者名
      大木理恵子,園山貴之,石橋敏章,石崎松一郎,長島裕二
    • 学会等名
      第113回日本食品衛生学会学術講演会
  • [学会発表] 魚貝類の毒 マリントキシン2017

    • 著者名/発表者名
      長島裕二
    • 学会等名
      平成29年度第1回愛知県衛生研究所技術研修会
    • 招待講演
  • [備考] 東京海洋大学食品生産科学科生体物質化学研究室

    • URL

      http://www2.kaiyodai.ac.jp/~ishizaki

  • [備考] 県立広島大学研究者総覧

    • URL

      https://hiris.pu-hiroshima.ac.jp.profile.ja.URMxjJneLsbeTC2WjYA==.html

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公開日: 2018-12-17  

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