| 研究課題/領域番号 |
15H04551
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
荒川 修 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 教授 (40232037)
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| 研究分担者 |
山田 明徳 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 准教授 (40378774)
高谷 智裕 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 教授 (90304972)
山口 健一 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 准教授 (90363473)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | テトロドトキシン / フグ毒結合性タンパク質 / PSTBP / トラフグ / 次世代シーケンサ |
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| 研究実績の概要 |
まず、成長／成熟段階の異なるトラフグの各部位について、PCRによりTr群遺伝子の発現プロファイルを調べた。その結果、いずれの段階においても、肝臓にのみTr1、Tr2、およびTr3の発現が確認された。次いで、二次元電気泳動によって各部位のトータルタンパク質を分離し、抗Tr抗体を用いたウェイスタンブロット法によりTr群と推定される複数のタンパク質を選択した。これらにつき、現在、TOF-MSによる構造解析とPro-Ｑ Emeraldキットによる糖鎖修飾の解析を並行して進めている。
一方、成熟段階の異なるトラフグ試料につき、次世代シーケンサを用いた遺伝子発現解析を引き続き行っている。今回、部位毎にcDNAライブリーを構築して発現遺伝子の同定と定量化を行う従来の方法とともに、転写開始点から確実に配列を解読する新たな方法（CAGE法）による解析も追加して行った。従来の方法では、Trのように類似の配列がタンデムに連結されているような場合に発現量の定量化やアイソフォームの同定が困難であるという欠点があったが、転写開始点からの解析を追加することで、より高精度な発現プロファイルが得られつつある。
他方、淡水フグPao suvattiiの人工飼育個体から肝臓、皮、および消化管の組織切片を作成し、テトロドトキシン（TTX）またはサキシトキシン（STX）を含む培地で一定時間培養後、各切片の毒取り込み量を測定した。その結果、いずれの組織もSTXの取り込み量がTTXを上回った。特に消化管ではTTXはほとんど取り込まれず、STX取り込み量との差が最も顕著となった。現在、このような毒選択の分子機構について検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
研究実績の概要に記載のとおり、CAGE法とPro-Q Emeraldキットの導入により、より高精度なcDNA発現プロファイの解析や糖鎖修飾の解析が可能となりつつある。しかしながら、依然として性成熟が十分に進んだ雌個体の入手が困難であったことに加え、タンパク質レベルでの解析が遅れているため、成長段階や成熟段階によるTr群発現プロファイルの相違を明らかにするには至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
トラフグ養殖業者との連携により、性成熟が十分に進んだ雌個体を安定して入手する目途がたった。成長段階や成熟段階が異なる養殖トラフグを雌雄別に複数個体購入し、昨年度に引き続いてcDNAシーケンシングとタンパク質レベルでの発現解析を並行して行い、Tr群発現プロファイルに関するデータを集積する。cDNAシーケンシングではCAGE法を併用し、毒輸送関連遺伝子のみならず、卵黄形成関連遺伝子や各組織における毒レセプター遺伝子の探索も視野に入れて解析を行う。
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