| 研究課題/領域番号 |
15H04577
|
|---|
| 研究機関 | 東京海洋大学 |
|---|
研究代表者 |
鈴木 徹 東京海洋大学, その他部局等, 教授 (50206504)
|
|---|
| 研究分担者 |
川井 清司 広島大学, 生物圏科学研究科, 准教授 (00454140)
萩原 知明 東京海洋大学, その他部局等, 教授 (20293095)
黄川田 隆洋 国立研究開発法人農業生物資源研究所, その他部局等, 研究員 (60414900)
鈴木 大 九州大学, 学内共同利用施設等, 助教 (90647489)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| キーワード | ヌマエラビル / 冷凍 / 凍結耐性 / 飼育 / 遺伝子解析 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は、ヌマエラビル（Ozobranchus jantseanus）の凍結耐性機構の解明、および体内に存在する保護物質を特定し、その利用性を明らかにすることを目的とする。H27年度は、ヌマエラビルの育種技術確立を目指し、宿主であるカメの飼育施設の設置を計画したが、設置場所の制約から、サイズ仕様の変更を行ったため、年度内に達成されなかった。引き続き、カメの飼育と当該寄生をする手法の確立をダウンスケールして検討する。一方で、近隣の池から採取できたヌマエラビルを用いて、凍結前後での細胞組織の構造変化の顕微観察を行ったところ、凍結条件によって一部、細胞核の損傷が観察された。細胞核の損傷と個体の生死について、手がかりとなる情報を得た。また、遺伝子からの予備情報としてゲノムサイズ決定、paired-endゲノムライブラリの作成等、トランスクリプトーム解析への準備が整った。上記と関連したメタボローム解析より、凍結前後で物質A（特許申請中）の体内濃度が優位に上昇することが明らかとされたため、物質A（特許申請中）の生物に対する凍結乾燥保護効果につき、確認試験を行ったところ、優位な効果が認められた。一方、凍結貯蔵したヌマエラビル体液を含む溶液中で生成した氷結晶成長の速度論的解析を行う手法の確立を行った。その結果、凍結貯蔵時間2時間以内で氷結晶成長を定量的に評価する方法を確立し、既往の方法と比較して、凍結貯蔵時間の短縮に成功した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1. ヌマエラビルの飼育技術の確立（鈴木 大）：当初予定していた実験施設（東京海洋大学吉田ステーション）の利用が困難となったため、新たに東京海洋大学品川キャンパス内に飼育設備を設置し、準備を進めている。
2.ヌマエラビルの凍結耐性機構の解明 ＜2.1. ヌマエラビルの凍結組織の静的形態評価・分光学的評価（代表者）＞：現有DSCを用いて凍結・解凍を繰り返した個体の凍結状態・解凍後の状態の作成に成功した。さらに、蛍光顕微鏡で観察を行い損傷部位特定と氷結晶の局在状態の把握を行った。その結果、凍結は細胞内凍結、あるいは消化器官内容物の凍結であること、損傷を受けて一部の核の崩壊に関係していることが明らかにされた。
＜2.2. ヌマエラビルの遺伝子発現解析（黄川田）＞：ヌマエラビルの凍結耐性の本質を解明すべく、ゲノム解析に着手した。フローサイトメーターを用いた解析から、ヌマエラビルのゲノムサイズは190 Mbであることが分かった。また、ゲノムDNAを単離し、1.5kbインサートサイズのpaired-endゲノムライブラリの作製、網羅的な塩基配列解析（PE100）を行った。
＜2.3. ヌマエラビルおよび体内成分の氷結晶成長に関する速度論的評価（萩原）＞：凍結貯蔵したヌマエラビル体液添加溶液中で生成した氷結晶成長の速度論的解析を行う手法を検討し、2ｈr以内で氷結晶成長を定量的に評価する方法を確立した。
＜2.4. ヌマエラビルおよび体内成分のガラス転移特性評価（川井）＞：黄川田Gによるメタボローム解析より、凍結前後で物質A（特許申請中）の体内濃度が優位に上昇することが明らかとされたため、生物に対する凍結乾燥保護効果の解明を前倒しで検討し、常温保存中に死滅する乾燥乳酸菌に物質A（特許申請中）を加えておくと、保存性が飛躍的に向上することが明らかとなった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
H27年度に得られた成果を反映させ、ヌマエラビルの育種技術確立をさらに充実し、確実なものにする。同時に、凍結耐性解明への動物学的アプローチ、遺伝生化学的アプローチ、ガラス化分子論的、および、氷結晶生成機構からアプローチを各専門家で引き続き行う。そして、新仮説を作成し、最終年度の研究方向性を決定することとする。
具体的には以下の通りである
飼育法の確立に向け、当初予定していた実験施設（東京海洋大学吉田ステーション）での利用が困難となったため、新たに東京海洋大学品川キャンパス内に小型飼育設備の設置を行う。また、本年度はヌマエラビル生息環境条件の調査を京都府京都市内の寺院の池で行った。この寺院は複数の池を有し、それぞれにクサガメやニホンイシガメが生息しているが、池ごとにヌマエラビルの寄生率が異なっており、水質によるものではない要因であることが示唆された。引き続き、要因特定を行う。光学顕微鏡、蛍光顕微鏡の観察においては、個体がダメージを受けている細胞は、損傷を受けて一部核の崩壊が関係していることが明らかにされた。引き続き同様の手法により、核の崩壊の有無、原因についての検討を行う。
一方、遺伝子的アプローチにおいて、次年度はトランスクリプトーム解析を行い、ゲノムにおける、近種との差異を特定する。さらに、凍結保護物質である可能性が示唆された物質A（特許申請中）については、次年度は、その効果をガラス転移物質であるかの検討と、新たに開発された氷結晶成長の速度論的解析手法を用いて、氷結晶成長に対する効果について検討する。
|
