研究課題
本年度は計画に記したとおり、低浸透圧ストレス依存的にASK3がリン酸化されることを指標として、そのリン酸化を制御する遺伝子をゲノムワイドsiRNAスクリーニングにより探索した。その結果、これまで浸透圧変化に応答することが報告されていたシグナル伝達経路や細胞膜に存在するタンパク質がASK3制御因子の候補として得られた。これらの遺伝子は既に行っていた高浸透圧によるASK3の脱リン酸化を担う遺伝子群とは異なっていたため、低・高浸透圧それぞれで異なるシステムが独立にASK3のリン酸化制御を担っていることが示唆された。ASK3特異的クロスリンクによるASK3結合分子の同定についても実施し、高浸透圧ストレス下でのみASK3にクロスリンクされ、SDS-PAGE上で観察されるタンパク質のバンドを質量分析計により同定した。その結果、クロスリンクされたものは多くがASK3自身であることが明らかになった。この結果は高浸透圧依存的にASK3が密に集合することを示唆するものと考えられる。現在までには主要なバンドしか解析できていないため、観察される他のバンドも同様に解析し他の結合タンパク質を同定する予定である。また、このクロスリンク法だけでなく、高浸透圧で形成されるASK3顆粒に含まれるタンパク質を網羅的に同定するために、新たにASK3顆粒の形を保ったまま細胞から抽出する方法の確立に成功したため、こちらの方向からもASK3結合タンパク質の同定を行う。ASK3と共に注目するもう一つの主要分子であるNFAT5の核移行を指標としたゲノムワイドsiRNAスクリーニングも計画通り本年度に実施し、実際にNFAT5の核移行に大きな影響が認められる遺伝子を網羅的に同定できており、今後分子メカニズムを解析することで浸透圧応答や免疫細胞の分化・増殖に重要なNFAT5の新たな制御メカニズムを提唱できると考えている。
1: 当初の計画以上に進展している
まず、本年度計画していた実験については全て滞りなく完遂することができた。これにより、ASK3の浸透圧ストレス依存的リン酸化変化を指標としたもの、NFAT5の浸透圧ストレス依存的核移行を指標にしたもの、それぞれのゲノムワイドsiRNAスクリーニングの結果を既に得ることができた。次年度に行う計画であったこれら候補遺伝子の具体的な分子レベルの解析について既に着手しており、研究は計画以上に進展している。また、ASK3の結合分子探索も、特異的クロスリンク法では今のところASK3自身が同定されているだけだが、引き続き解析を行うことで他の結合分子が得られる可能性は十分にある。さらに、計画にはなかったASK3顆粒を細胞から単離する方法の確立に成功しており、こちらのアプローチからクロスリンク法だけでは同定が難しかったASK3顆粒に含まれるタンパク質の網羅的な同定に着手できるようになった。これら2つの方法でASK3結合分子の同定に取り組むことでより確実性の高い研究が進められると考えている。
現在までに順調に研究は進捗しているので、基本的には研究計画に沿った形で研究を進める。特にASK3結合分子の同定については、ASK3顆粒自体の単離という計画には無かった別の方法からのアプローチが可能になったため、こちらの方法も加えて解析を進める。
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Sci. Rep.
巻: 6 ページ: 18710
10.1038/srep18710
http://www.f.u-tokyo.ac.jp/~toxicol/index.html
